间接elisa实验流程

间接法酶联免疫吸附检测操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor.I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!间接法酶联免疫吸附检测（ELISA）的操作流程详解间接法酶联免疫吸附检测（ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的敏感、特异的检测技术。

间接elisa原理一、引言酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物学、医学等领域的分析方法。

其中，间接ELISA是其中一种常用的方法。

它通过特定的抗体与抗原相互作用，利用酶做标记来检测样品中是否存在目标物质。

本文将详细介绍间接ELISA的原理。

二、实验步骤1.涂布：将待测物质（如蛋白质）溶液加入到微孔板中，使其在孔壁上均匀地吸附。

2.阻断：在孔壁上添加非特异性蛋白（如牛血清白蛋白），以避免后续步骤中非特异性结合。

3.加入第一层抗体：加入与待测物质相对应的第一层抗体，并与待测物质结合形成复合物。

4.加入第二层抗体：加入与第一层抗体相对应的酶标记二抗，并与第一层抗体结合形成复合物。

5.加入底物：加入底物，使酶催化反应产生可检测的信号。

6.测定：利用光密度计等设备测定底物反应产生的吸光度，从而判断待测物质是否存在。

三、原理解析1.抗原-抗体反应间接ELISA是基于抗原-抗体反应的原理。

在实验中，待测物质（如蛋白质）被吸附到微孔板上，并与第一层特异性抗体结合形成复合物。

此时，如果样品中存在与待测物质相对应的第二层抗体，则第二层抗体会与复合物结合形成更大的复合物。

这种特异性的结合反应是ELISA检测方法的核心。

2.酶标记在间接ELISA中，酶标记是检测结果可视化的关键。

在实验中，第二层抗体被标记上酶（如辣根过氧化物酶），当底物被加入时，酶催化底物产生可检测的信号（如荧光、发光、颜色变化等）。

这种信号可以通过吸光度计等仪器来检测和量化。

3.非特异性结合在实验中，非特异性结合是需要避免的。

为了避免非特异性结合，实验中会加入一定量的阻断剂（如牛血清白蛋白），以防止非特异性蛋白质与抗体结合。

4.优缺点间接ELISA具有以下优点：（1）灵敏度高：ELISA可以检测极低浓度的物质，通常可以检测到纳克/毫升级别的物质。

（2）特异性强：ELISA可以区分不同种类的物质，因为它是基于抗原-抗体反应的原理。

间接法测抗体的原理
间接法测抗体的原理
间接法测抗体是一种常用的免疫学实验技术，其原理是利用已知抗原与待测样品中的抗体结合，再通过添加标记二抗来检测待测样品中是否存在特定的抗体。

具体步骤如下：
1.将已知的抗原分别涂在固相载体（如ELISA板）上。

2.加入待测样品，使其与涂有抗原的固相载体发生反应。

如果待测样品中存在特定的抗体，则会与抗原结合。

3.洗去未结合的物质，保留结合了特定抗体的复合物。

4.加入标记二抗（如HRP标记的兔抗鼠IgG），该二抗能够与待测样品中特定的抗体结合形成复合物。

5.洗去未结合的标记二抗，在适当条件下加入底物（如TMB），使其发生显色反应。

6.根据显色反应强度可以判断待测样品中是否存在特定的抗体。

优点：
1. 间接法可同时检测多个不同种类、来源和亚型等不同性质的蛋白质分子，具有高灵敏度和高特异性。

2. 二抗标记可用多种方法进行标记，如HRP、酶联荧光等，可根据需要选择不同的标记方法。

3. 间接法操作简单，适用于大规模筛查。

缺点：
1. 间接法需要较长的检测时间。

2. 检测结果受到非特异性因素影响较大，如污染、交叉反应等。

综上所述，间接法测抗体是一种常用的免疫学实验技术，其原理是利用已知抗原与待测样品中的抗体结合，并通过添加标记二抗来检测待测样品中是否存在特定的抗体。

该方法具有高灵敏度和高特异性等优点，但也存在一定的缺点。

精选全文完整版酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序第一节间接ELISA试验一用可溶性抗原的ELISA：1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h；4、PBST洗三次；5、每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。

若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；8、37（度）孵育2h9、PBST洗5次，每次5min10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP 标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；11、37（度）孵育2h12、PBST洗5次，每次数5分钟；13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；16结果判定：（1）P/N≥2.1 为阳性(2) P≥N+3SD 为阳性成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。

二、用全菌抗原的ELISA法（一）GA法1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。

注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时3、蒸馏水洗5次;4、加细菌悬浮液,50ul/孔;5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)6、加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；8、以下步骤同一。

间接ELISA法检测血清抗体1. 仪器耗材（1）仪器：洗板机，酶标仪，恒温箱（2）耗材：96孔酶标板（NUNC或海门），加样槽2. 试剂及配制（1）包被缓冲液：A. PBS (500ml，pH=7.2±0.1)：NaCl 4.25g，NaH2PO4·2H2O 0.178g，Na2HPO4·12H2O 1.386g，溶解定容至500ml，测量pH在7.1-7.3（若超出此范围则不能使用）。

常温可保存一周。

B. 1×碳酸盐缓冲液（100ml，pH=9.6）：Na2CO3 0.2756g，NaHCO3 0.6216g，溶解定容至100ml水，测量pH在9.5-9.7之间（若超出此范围则不能使用）。

4℃可保存一个月。

（2）洗液：0.5%PBS’T（1L）：每1L PBS（pH=7.2±0.1）加入Tween-20 5ml，充分混匀。

（3）封闭液：A. 2.5%drymilk/PBS’T（100ml）：将2.5g drymilk溶解于100ml PBS’T中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃。

B. 10%FBS/PBS’T（100ml）：10ml FBS于90ml PBS’T混合，短期保存与4℃。

（4）稀释缓冲液：A. 2.5%drymilk/PBS’T：配方同上。

B. 10%FBS/PBS’T：配方同上。

C. 2.5% dry milk EDTA/EGTA PBS’T：C-1：EDTA/EGTA PBS’T：1.117g EDTA加入至100ml PBS’T中，搅拌至溶解（大约15min）；1.141g EGTA加入至100ml PBS’T中，搅拌（大约15min），待部分溶解后，用10N 的NaOH调节pH至7.0；上述两种溶液以1：1的比例混合，测量其pH值在6.3±0.5之间，在上述溶液中按照2.5%的比例加入脱脂奶粉。

D. 10%FBS EDTA/EGTA PBS’T：D-1：EDTA/EGTA PBS’T：配方同上，在上述溶液中按照10%的比例加入FBS。

间接法ELISA SOP一、包被1．抗原包被量为20µg/板。

2．例如：抗原浓度为0.8mg/ml。

3．取25µl抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，100µl/孔。

4．包被完毕后，4℃过夜。

二、封闭1．从4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。

2．加封闭液，200µl/孔。

3．37℃孵育2h。

4．甩干，洗板（3次）。

5．用干燥的自封袋4℃保存。

【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加200µl -300µl洗板液，静置2min，甩出，将板拍在干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。

三、一抗1．可洗板一次。

2．阳性对照：1µl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做1：1000稀释（第一孔）。

3．阴性对照：做1：2万稀释。

用1µl阴性血清加入100µl抗原稀释液中，先做1：100稀释。

再从此液取出5µl加入995µl的抗原稀释液中，最终稀释为1：2万。

4．空白对照：只加抗原稀释液。

5．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100µl抗原稀释液。

6．第一孔加100µl（1：1000）的阳性对照。

7．第二孔加100µl（1：1000）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100µl加到3号孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。

1：10001：20001：40001：80001：160001：32000阴性对照（1：2万）空白对照8．将酶标板37℃孵育1h，洗板3次。

【注】：①通常在第一次做Elisa时，应该做阴性对照的梯度稀释，从中选择最佳的稀释倍数(一般认为吸光值小于0.1的阴性稀释倍数为易)。

②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。

③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。

四、二抗本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1．用0.01MPBS做1：5000稀释（现用现配）。

间接ELISA的原理及应用1. 什么是间接ELISA间接ELISA全称为酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用的免疫学检测方法。

它依靠特定抗原和抗体之间的高度专一性反应，通过酶标记抗体或抗原的相互作用来检测目标物质的存在和浓度。

2. 间接ELISA的原理间接ELISA的原理是将待测物与特定抗原偶联到固定在微孔板上的抗原表面上。

然后引入与待测物特异性结合的酶标记抗体，使其与待测物结合。

接下来，通过添加底物，酶标记抗体催化底物的变色反应，从而间接检测出待测物的存在。

间接ELISA的步骤如下：1.固相涂布：将抗原溶液均匀涂布在微孔板上，使其在孔壁上固定。

2.阻断：加入一定浓度的非特异性抗体，使其与未吸附的表面结合，防止非特异性的结合。

3.加入待测物：将待测物标本加入到微孔板中与固相抗原发生特异结合。

4.加入检测抗体：加入配有酶标记的抗体，该抗体有望与待测物结合形成夹心免疫复合物。

5.洗涤：洗涤微孔板以去除未结合的物质。

6.加入底物：加入含有底物的试剂，底物受到酶催化产生变色反应。

7.阅读测量：使用酶标仪对底物反应产生的颜色进行定量检测。

3. 间接ELISA的应用间接ELISA广泛用于医学、生命科学研究、生物制药和农业领域。

以下是间接ELISA在不同领域的应用：3.1 医学领域间接ELISA在医学领域的应用非常广泛，主要用于以下几个方面：•临床诊断：可以用于检测疾病的早期诊断，如艾滋病、肝炎、结核病等。

•药物监测：可以测定药物的浓度，监测药物治疗的疗效和剂量。

•免疫学研究：可用于研究免疫系统的功能和疾病发生机制。

3.2 生命科学研究间接ELISA在生命科学研究中也有广泛的应用，主要用于以下方面：•蛋白质检测：可以用于检测目标蛋白质在细胞或生物体中的表达量。

•抗体研究：可以用于检测抗体在细胞或液体中的浓度，了解免疫应答和抗体产生的情况。

•基因表达：可以用于检测转基因植物或动物中目标基因的表达水平。

ELISA操作步骤酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。

双抗体夹心法是ELISA的一种常见方法，也被称为间接ELISA。

该方法通过将待测抗原与特异性抗体结合，然后将该复合物夹在两种抗体之间，从而实现检测目标物的定量。

以下是ELISA操作步骤（双抗体夹心法）：1.准备所需试剂和设备，包括等量酶联免疫吸附试剂，洗涤缓冲液，检测抗体，底物液和浓缩液。

2.预先涂上酶标板：用特异性抗体溶液将酶标板的孔涂覆。

将抗体溶液加入每个孔中，然后在常温下孵育2小时或过夜在4°C下孵育。

孵育结束后，将溶液倒掉，然后用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的抗体。

3.加入待测样品：将待测样品加入酶标板中，然后在常温下孵育1小时。

孵育结束后，倒掉孵育液，并用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的样品。

4.加入检测抗体：将检测抗体加入酶标板孔中，然后在常温下孵育1小时。

检测抗体可以与目标物中的特异性抗体结合，并形成夹心复合物。

5.加入底物液：将底物液加入每个孔中，然后在室温下孵育20-30分钟。

底物液通常含有染色剂，当底物液与酶产生反应时，颜色会发生变化。

6.停止反应：在孵育结束后，加入停止液停止反应。

停止液会改变底物液的pH值，从而停止酶的反应。

这将保持颜色稳定，并允许结果的定量测量。

7.结果分析：使用酶标仪读取每个孔的吸光值。

这些吸光值可以用于计算样品中目标物的浓度。

通常，在酶标板上设置标准曲线，用于根据吸光值确定目标物的浓度。

8.清洗：在每个步骤之后，用洗涤缓冲液充分清洗酶标板。

洗涤的目的是去除未结合的试剂和非特异性物质，以确保结果的准确性。

9.数据处理和统计分析：根据读数结果计算样品中目标物的浓度，并进行统计分析。

常见的统计方法包括均值、标准差和方差。

以上是双抗体夹心法ELISA的一般操作步骤。

在实际操作中，可能会根据具体要求进行一些调整和优化。

同时，实验室安全操作规范和个性化要求也需要被遵循和注意。

elisa间接法原理
Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，它可以用来检测和定量分析目标物质（如抗体、抗原、蛋白质等）的存在和浓度。

Elisa间接法是其中一种常见的Elisa技术。

Elisa间接法的原理基于免疫反应的特性。

它利用特异性的抗体与待测物质发生反应，通过观察或测量信号的强度来确定目标物质的存在和浓度。

下面是Elisa间接法的步骤：
1. 修复：将待测样品固定在试板上，通常是通过加入乙醛或其他化学物质来使样品中的蛋白质固定在试板表面。

2. 阻断：添加阻断剂（如牛血清蛋白）来封闭未被固定的试板表面，以减少非特异性结合。

3. 第一次孵育：加入特异性的初级抗体，这些抗体会与待测物质结合。

初级抗体可以是针对待测物质的抗体，也可以是其他与待测物质无关但具有识别能力的抗体。

4. 第二次孵育：加入与初级抗体结合的辅助抗体。

这些辅助抗体通常是与初级抗体来源物种不同的抗体，可以通过酶标记、荧光标记等方式进行标记。

5. 底物添加：加入合适的底物，底物会与酶标记的辅助抗体发生反应，并产生可观察的信号（如颜色变化、荧光强度）。

6. 反应停止：通过添加反应停止剂，终止底物的反应过程。

7. 信号检测：使用光谱仪、荧光仪或其他相关设备，测量底物反应生成的信号的强度，该信号的强度与目标物质的存在和浓度相关。

Elisa间接法通过利用辅助抗体的酶标记或标记物来放大信号，提高对目标物质的灵敏度和检测能力。

它具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围，在医学诊断、生物学研究和药物开发等领域得到广泛应用。

1。