蛋白质晶体的生长冻存及装载

生物样品储存方法概述-冷冻保存将需要冷冻的样品冷冻（freezing,放于-20?C或-80?C）得当能有效的保证样品质量！下面给大家安利几种常见样品的冷冻储存方式：DNA及缓冲液：对于基因组材料来说，收到轻微的机械剪切力不是什么大事情；对于不稳定的缓冲液，如含有DTT的缓冲液，可直接冷冻储存，无需调整。

蛋白：需要添加防冻剂用于蛋白的冷冻储存。

蔗糖或甘油是防冻剂很好的选择，但对于不同的蛋白，蔗糖或甘油所占的百分比须有所不同。

可选择20％的蔗糖或10％的甘油。

限制性内切酶可以储存在50％甘油中以保持稳定性。

由于较低的冷冻温度，这种甘油的浓度可防止溶液完全冻结！微生物（细菌，酵母和真菌）：10-20％甘油效果很好。

更高的百分比（即更接近20％）使平板划线更加容易。

高等真核细胞：常见的的冷冻过程为（仅供参考）：1. 配制含10% DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。

也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

8．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。

在冻存前一天最好换一次培养液；9．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；10．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

蛋白储存buffer条件
1. 低温储存：蛋白应该以冷冻或低温的方式储存，通常在-
20°C或更低的温度下。

低温可以防止蛋白质降解、失活或产
生聚集。

2. pH适宜：选择适当的缓冲液来调节蛋白的pH值。

pH过高
或过低都可能导致蛋白质失活或聚集，因此应选择pH稳定的
缓冲液。

3. 高盐浓度：加入适当浓度的盐可以增加蛋白在储存过程中的稳定性，减少蛋白质聚集或失活的风险。

4. 防止冻融循环：频繁冻融会导致蛋白质的失活和降解。

因此，应该避免反复的冻结和解冻，一次性分装成适量的小份，以减少冻融次数。

5. 避光：蛋白质容易受到光照的影响而降解，所以应该避免阳光直射或强光照射。

6. 无菌条件：储存容器和使用过程中应保持无菌，以防止细菌或其他微生物的污染。

7. 添加保护剂：可以在蛋白储存buffer中添加一些保护剂，如甘油、蔗糖、D-己糖等，以增加蛋白质的稳定性和储存寿命。

尽管以上条件是通用的蛋白储存buffer条件，但具体的储存条件仍需根据具体蛋白质的特性和研究要求来确定。

保存蛋白样品应该遵循的原则：1. 低温低温下保存蛋白质是极其必要的。

低温意味着更低的能量，低温下蛋白质分子热运动较低，其内部的成键不容易断裂。

另外，在低温下，微生物不容易生长，可能存在的蛋白酶的活性也会很低，这些更容易保证蛋白质的活性。

2. 分装蛋白质有时候是需要冷冻保存的，但我们使用蛋白质时却是在室温或者更高的温度。

冻融这一过程会对蛋白质造成不可逆的损伤。

因此我们需要尽量减少冻融的次数。

纯化后的蛋白质，进行分装保存，每次需要多少便融化多少，保证蛋白质样品只经历一次冻融。

3. 浓缩纯化后的蛋白质尽量以高浓度保存，浓度最好在1mg／ml以上，高浓度更有利于蛋白质的稳定。

高浓度的另一个好处是防止蛋白质分子黏贴在塑料或玻璃材质的管壁上。

不要惊讶哟，疏水性蛋白质是很容易粘贴在管壁上的。

4. 速冻／速融（Flash freeze）在蛋白质溶液冷冻的过程中，纯水首先结冰，蛋白质分子会被暴露在极高的盐浓度或pH下，这会破坏蛋白的活性。

因此，需要尽可能缩短冷冻的过程。

速冻可以在液氮中进行，也可以在干冰，乙醇和丙酮的混合物中进行。

速冻后，蛋白质可以保存在-20度或-80度中。

同样的道理，蛋白质融化的过程也要尽可能的快速，可以在温水中进行。

5. 添加剂蛋白质需要保存在合适的缓冲液中。

同时缓冲液中还可以添加一些保护剂，比如保存在-20度时，可以添加10%-50%的甘油，这样可以防止蛋白质冷冻，不需要经历冻融。

同时还可以添加一些抗菌试剂，比如叠氮化钠（sodium azide），可以防止细菌生长。

或者蛋白酶抑制剂（PMSF），抑制蛋白酶对蛋白质的破坏。

另外，还可以添加一些还原剂，如DTT，防止蛋白质的氧化。

在选择添加剂时，一定要保证所加试剂不会影响到蛋白的活性。

保存方法蛋白质的的保存方法的选择完全取决于蛋白质的稳定性以及保存后什么时候再次使用你的蛋白。

1.短期保存（1周内）：对于短期保存，大多数蛋白可以保存在4 摄氏度下。

蛋白质结晶和蛋白质晶体学方法蛋白质是生命体内最重要的分子之一，也是药物研发、生命科学、工业等众多领域的研究热点。

而对于研究蛋白质，关键的一步就是蛋白质的结晶和晶体学研究。

什么是蛋白质结晶？蛋白质结晶指将溶解在水中的蛋白质在特定的条件下，使其形成一定大小的晶体，以便使用X射线晶体学等技术进行分析结构。

通常情况下，蛋白质结晶需要满足以下条件：溶液中需要有足够浓度的蛋白质分子；结晶试剂可以形成稳定的络合物，可以帮助蛋白质分子快速结晶；结晶条件需要控制好pH、温度、离子强度等因素。

蛋白质晶体学方法蛋白质晶体学方法是一种通过分析蛋白质晶体的结构来了解蛋白质内部结构、功能和作用方式的研究方法。

最常用的是X射线晶体学方法。

利用X射线照射蛋白质晶体，通过测定射线衍射图案来确定蛋白质的结构。

其它方法包括核磁共振（NMR）方法、电子显微技术及光学方法等。

挑战和发展蛋白质结晶和晶体学研究仍然是一个充满挑战的领域。

一方面，很多蛋白质很难结晶或者很难得到足够质量的结晶。

另一方面，即使蛋白质结晶，其结构分析也需要复杂的处理和计算步骤，需要强大的计算机能力和足够的数据存储空间。

更进一步，目前蛋白质晶体学方法虽然已经有了很大的进步和发展，但仍然存在一些不确定性和局限性，例如确定结晶的完整性和误差，以及判断蛋白质在溶液中的行为等问题。

虽然蛋白质结晶和晶体学研究仍然存在挑战和局限性，但是众多研究者依然在探索新的技术和方法，以期在研究蛋白质结构和功能方面达到更深入的了解。

未来的一些新技术，如X射线自由电子激光，以及更加稳定的冷冻电镜技术，都有望在蛋白质结晶和晶体学研究领域有更大的应用前景。

总体来说，蛋白质结晶和晶体学方法在生命科学和药物研发领域的作用已经被证实，是极其重要的研究手段之一。

蛋白质结晶方‎法大总结1.1结晶方法(Crysta‎l lizat‎i on Techni‎q ues)1.1.1 分批结晶(Batch Crysta‎l lizat‎i on) 这是最老的最‎简单的结晶方‎法，其原理是同步‎地在蛋白质溶‎液中加入沉淀‎剂，立即使溶液达‎到一个高过饱‎和状态。

幸运的话，不需进一步处‎理即可在过饱‎和溶液中逐渐‎长出晶体。

一个用于微分‎批结晶的自动‎化系统已被C‎h ayen等‎人设计出（1991，1992），其微分批方法‎中，他们在1-2μl包含蛋‎白质和沉淀剂‎的液滴中生长‎晶体。

液滴被悬浮在‎油（如石蜡）中，油的作用是作‎为封层以防止‎蒸发，它并不干扰普‎通沉淀剂，但是干扰能溶‎解油的有机溶‎剂(Chayen‎, 1997; see also Chayen‎, 1998)。

1.1.2 液-液扩散(Liquid‎–Liquid‎Diffus‎i on) 这种方法中，蛋白质溶液和‎含有沉淀剂的‎溶液是彼此分‎层在一个有小‎孔的毛细管中‎，一个测熔点用‎的毛细管一般‎即可（如图1.2）。

下层是密度大‎的溶液，例如浓硫酸铵‎或P EG溶液‎。

如果有机溶剂‎如M PD被用‎作沉淀剂，它会在上层。

以1：1混合，沉淀剂的浓度‎应该是所期最‎终浓度的二倍‎。

两种溶液（各自约5μl‎）通过注射器针‎头导入毛细管‎，先导入下层的‎。

通过一个简易‎的摇摆式离心‎机去除气泡。

再加入上层，进而两层之间‎形成一个明显‎的界面，它们会逐渐彼‎此扩散。

Garc´?a-Ruiz and Moreno‎（1994）已经发展液-液扩散技术至‎针刺法。

蛋白质溶液通‎过毛细力被吸‎入狭窄的管中‎，管的一端是封‎闭的。

接着，开放端被插入‎置于小容器的‎凝胶中，凝胶使得管竖‎直，蛋白质溶液与‎凝胶接触。

含有沉淀剂的‎溶液被倒在凝‎胶上，整个装置被保‎存于封闭的盒‎子以防蒸发。

沉淀剂通过凝‎胶和毛细管的‎扩散时间可以‎由毛细管插入‎凝胶的深度控‎制，从而蛋白质溶‎液中即可形成‎过饱和区域，毛细管底部高‎而顶部低。

生物晶体学和蛋白质结晶的技术和应用生物晶体学是指利用晶体学的方法研究生物大分子（如蛋白质、核酸等）的结构和性质的科学分支。

而蛋白质结晶则是在生物晶体学中最为核心，也是最重要的一个部分。

一、蛋白质结晶的历史和发展蛋白质结晶的历史可以追溯至19世纪末，当时科学家们就开始利用显微镜观察蛋白质结晶。

而直到20世纪初，随着X射线晶体学的兴起，人们才开始用X射线衍射技术研究蛋白质结晶。

尽管如此，由于蛋白质的结晶过程相对复杂，因此当时只能成功获取很少的实验数据。

随着电子显微镜、分子生物学技术等的发展，蛋白质结晶技术也出现了可喜的进展。

特别是在20世纪后期，由于先进的计算机技术和图像处理技术的应用，蛋白质结晶技术得以取得了很大的突破。

如今，蛋白质结晶技术已成为现代生物科学中极其重要的手段之一，其在新药研发、疾病诊断、生物质谱分析等方面也有着广泛的应用。

二、蛋白质结晶的原理和方法蛋白质结晶是指将蛋白质分子由溶液状态变为晶体状态的过程。

中间的过程相对复杂，一般包括表达蛋白质、净化蛋白质、制备试剂和晶体培养等步骤。

在这些步骤中，特别是在晶体培养阶段，有很多不同的方法可以用来促进蛋白质分子合成晶体。

例如，常见的方法包括透析结晶法、毒运动法、温度梯度法、界面扩散法、离子交换法等等。

此外，蛋白质结晶的成功与否往往与晶体的质量和稳定性密切相关。

因此，为提高晶体的质量，科学家们还发展了一系列晶体加工技术，例如在晶体成长阶段利用不同的添加剂调整溶液的化学性质、利用超声波震荡或加热等方法来提高晶体的稳定性等等。

三、蛋白质结晶技术的应用除了在蛋白质结构分析方面有广泛的应用之外，蛋白质结晶技术还在其他领域有着重要的应用。

以下是一些蛋白质结晶技术的具体应用：1.新药研发药物分子与蛋白质分子的相互作用是药理学研究的核心。

因此，对药物分子与蛋白质分子相互作用机理的研究，是理解药理学的重要途径。

而蛋白质结晶技术可以为这种研究提供重要的方法和手段，进而促进新药的研发和改良。

蛋白质保存(2011-02-19 13:05:48)转载▼标签：杂谈分类：专业蛋白质有什么比较实用的保存方法?1、冻成干粉，低温保存；2、甘油+防腐剂，低温保存，甘油浓度5%~50%，防腐剂一般选择NaN3，终浓度0.05%，但对于氧化酶类的蛋白，不能使用NaN3，推荐不加防腐剂，或者改加PMSF至终浓度1mM NaN3其剧毒性会不会影响蛋白活性?PMSF这种蛋白质水解酶抑制剂作用机理是怎么样的？NaN3防腐靠的就是它的毒性，它的生理毒性并不是通过非特异的影响蛋白活性来实现的。

提到毒性不要先想到摧毁一切，毒杀一切，人喜欢，人爱吃的东西，同样菌也爱吃，靠它们是不能抑菌的。

对蛋白活性的影响，我已经提醒了，就是氧化酶类的蛋白不能用NaN3；另外，大多数的蛋白、RNA酶抑制剂都是致癌或潜在致癌的，因为它有可能阻碍体内蛋白、RNA的正常更替。

PMSF通过与蛋白质的serine残基结合而达到抑制serine蛋白酶的作用。

例如trypsin chymotrypsin thrombin和papain等。

检测用的粗蛋白，全蛋白当然可以分装低温保存，制备级的呢？需要经常使用的蛋白纯品呢？当然最好是冻干，-80度存放，但经常使用的（比如抗血清、纯化的酶）最好采取公司商品化酶类的保存方法，就是50%甘油+低温，即保证了低温，甘油又保证了整个体系不会结晶，避免了反复冻融，而且甘油有稳定蛋白活性的作用。

问：纯化后的蛋白质4度保存约15天，怎么分子量发生了变化？答：蛋白质样品如果是溶液状态的，在4度下顶多保存一个礼拜。

15天太长了。

估计分降解成很多小蛋白。

电泳时出现很多条带。

在-20度也就是保存一个月。

最好的保存办法还是将蛋白样品冻干成粉末。

保存，这样保存的时间会很长。

如果条件不具备，-70度也可以。

蛋白样品最忌讳反复冻融。

答：蛋白保存应根据对活性的要求及蛋白的种类而定：抗体:除非一些公司特别要求-20℃冻存，一般4℃可稳定一年（无菌，如加叠氮钠），因为抗体是一种具有非常稳定结构的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根据需要小量保存4℃(一周）、-20℃(一个月)、-80℃(六个月)、液氮（基本无限期），反复冻融会导致诸多不良后果，如聚集、修饰、降解、污染等（取决于蛋白浓度、缓冲液成分及蛋白本身的特点）；冻干是一种很好的长期保存法（如条件具备），在大多数情况下可以很好地保存蛋白的活性，但不适于某些蛋白（因有些蛋白对冻干重溶时必然产生的盐离子浓度的急剧变化反应不佳，其活性会永久丧失（应具体对待，尚无规律可循）。

结构生物学Structural Biology蛋白表达系统有哪几种？•1).原核表达系统•2).酵母表达系统•3).昆虫表达系统•4).哺乳表达系统层析技术根据生物分子物理化学特性的不同而达到分离•Ion Exchange (IEX)－离子交换–电荷–可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化，根据等电点来选择•Size Exclusion (SEC)－分子筛（或凝胶过滤）–分子大小–用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化•Affinity (AC)－亲和–生物相互作用–用于复杂样品的最早捕获或中间纯化•Hydrophobic Interaction (HIC和RP) －疏水和反相–疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖蛋白质的含量测定•目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总蛋白含量；目前没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量；•最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考马斯亮蓝）、BCA法、紫外分光光度法等。

第三节、蛋白质晶体培养晶体的定义“由原子（或离子、分子）在空间周期排列构成的固体物质。

”注意：（1）一种物质是否是晶体是由其内部结构决定的，而非由外观判断；（2）周期性是晶体结构最基本的特征。

晶体的基本性质1、内部结构周期性2、对称性3、均一性4、各向异性5、自范性（自限性）6、最小内能性7、稳定性8、固定熔点9、晶面角守恒定律10、使X射线产生衍射清澈的蛋白质溶液↓饱和溶液↓过饱和溶液↓发生沉淀↓蛋白质的无定形沉淀条件，蛋白质就有可能以晶体形式从溶液中析出。

•蛋白质结晶原理与一般的小分子类似。

不同的是，蛋白质分子分子量大，蛋白质分子的不稳定性和敏感性较大，必须维持其基本水合状态，处于或接近生理pH及温度。

保持蛋白质分子的天然状态对蛋白质的结晶至关重要。

1234结晶相图饱和曲线晶体可能出现的区域？待白质分O X晶液清澈的蛋白质溶液↓饱和溶液↓过饱和溶液↓发生沉淀↓蛋白质的无定形沉淀条件，蛋白质就有可能以晶体形式从溶液中析出。

膜蛋白结晶（用于X射线结构研究）的一般实验方案蛋白结晶学被用来产生原子分辨率的蛋白分子结构。

这些结构可以提供关于蛋白的生物功能、代谢以及跟底物或者效应物（DNA、RNA、辅助因子或其他小分子、离子和其他蛋白质）间的相互作用的信息。

这一技术可以应用于膜蛋白。

但首先需异源表达或者从天然产物中纯化来获得膜蛋白。

必须要用温和的去垢剂从脂膜中提取出膜蛋白并且纯化到稳定均一的浓度才能结晶。

蛋白晶体通过X射线衍射产生目标蛋白原子分辨率的结构。

下文中我们介绍一种一般的实验方案用来产生衍射水平的蛋白晶体。

蛋白结晶的过程是十分易变的，获得衍射水平的晶体可能需要几周到几月的时间，有些情况下可能需要几年。

引言概述50年前X射线结晶学首先应用于解析肌红蛋白的结构，从那时起该技术便用来产生蛋白的原子模型向科学家提供它们的结构和功能信息。

然而，直到1985年光合反应中心结构的确定才标志着人们实现了从天然产物中提取的整合膜蛋白在原子水平的结构解析。

又过了十几年，异源表达的K离子通道KcsA3得到了结晶和结构解析。

获得膜蛋白结构的困难主要来自于如何产生结晶一般需要的毫克级纯的单分散性的膜蛋白。

此外，结晶过程中必须保证蛋白在离散折叠中和寡聚体状态下的稳定。

绝大多数情况下，我们发现纯、均一和稳定的蛋白溶液成功结晶的可能性最大。

从实验上看，一条有用的蛋白溶液标准是纯度>98%、均一度>95%和稳定度>95%，这种溶液未浓缩时可以在4℃下贮存2周，浓缩到结晶浓度后可以在4℃下贮存1周。

通常，一个有利的结晶筛选起始点是含有2mg蛋白的符合上述标准的溶液，即200ul10mg∙ml-1的蛋白溶液。

本文介绍的实验方案就是为了满足这些结晶标准。

本方案首先异源表达目标蛋白，然后进行膜分离、溶解、纯化、合适结晶条件的初步确定以及改进来增加晶体的体积和质量。

膜蛋白结晶的实验方案通常局限于特定的目标蛋白，尽管可能写得很详细，但并没有审视实验方案的演进，也没有解释表达、溶解、纯化或者结晶的条件是如何得来的。

生物冷冻蛋白技术生物冷冻蛋白技术是一种先进的生物学技术，它可以将蛋白质冷冻保存，并在需要时重新激活。

这项技术对于生物医学研究、药物开发和生物材料的保存等领域具有重要意义。

生物冷冻蛋白技术是利用低温冷冻的原理，将蛋白质保存在极低的温度下，以防止其活性和功能的丧失。

这种技术可以有效地延长蛋白质的保存时间，并在需要时重新激活蛋白质，使其恢复活性。

在生物医学研究领域，蛋白质是研究的重要对象。

通过冷冻蛋白技术，科研人员可以将蛋白质保存在冷冻状态下，以便长期研究。

这对于一些需要长时间进行实验的研究项目非常重要。

同时，冷冻蛋白技术还可以避免蛋白质在保存过程中的降解和变性，确保研究结果的准确性和可靠性。

在药物开发领域，冷冻蛋白技术也发挥着重要作用。

药物研发过程中，往往需要大量的蛋白质进行药物筛选和活性研究。

通过冷冻蛋白技术，科研人员可以将蛋白质保存在冷冻状态下，以便于随时进行药物筛选和活性测试。

这极大地提高了药物研发的效率和成功率。

冷冻蛋白技术还可以用于生物材料的保存。

生物材料是一类具有生物活性的材料，常用于组织工程、再生医学和生物传感器等领域。

这些生物材料往往需要保存一段时间后才能使用，因此需要一种有效的保存方法。

冷冻蛋白技术可以将生物材料冷冻保存，以防止其降解和失活，从而确保其在使用时的完整性和功能。

值得注意的是，冷冻蛋白技术在实施时需要注意一些关键因素。

首先是选择合适的冷冻介质和冷冻条件。

不同的蛋白质对冷冻介质和温度的要求可能有所不同，因此科研人员需要根据具体的蛋白质特性来确定最佳的冷冻条件。

其次是冷冻蛋白质的速度和方法。

较快的冷冻速度可以减少蛋白质的降解和变性，但过快的速度可能会导致结晶和损伤。

因此，科研人员需要在实践中进行不断探索和改进。

生物冷冻蛋白技术是一项具有重要意义的技术，它可以有效地延长蛋白质的保存时间，并在需要时重新激活。

这项技术在生物医学研究、药物开发和生物材料的保存等领域具有广泛的应用前景。