Transwell试验办法
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T r a n s w e l l细胞侵袭实验与移动实验
一、试剂和耗材
1)细胞及细胞培养基：KYSE150细胞、含10%FBS的RPMI1640培养基及无血清RPMI1640培养基。
2)10×PBS(pH7.0)：
Na2HPO4·12H2O（MW358.4）2.87g
KH2PO4（MW136.09）0.2g
NaCl（MW58.44）8.0g
KCl（MW74.55）0.2g
去离子水至100ml
高压灭菌后，室温保存。
使用液为1×PBS(用无菌水进行1：9稀释)。
3)冰乙酸:甲醛（1:3）
4)Transwell小室(BD,Bioscience)
5)Matrigel基质胶（BD,Bioscience，50ug/ml）：商品化，保存-20°。
6)各种规格的枪头、1.5ml离心管及10ml玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml的离心管于-20o C预冷，备
用。
7)5810R台式高速冷冻离心机（Eppendorf），TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad）
8)细胞计数板、6孔板
二、实验步骤
（一）侵袭实验
1.润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min。
2.细胞准备：在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入5ml无血清培养基，常规培养24h。
3.细胞的接种：
1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1min以内。
2)加入4℃预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），
水平转子4℃、700rpm/min，离心5min；
3)弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；
4)弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细胞密度大于1.5×105/ml），
轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-RadTC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-RadTC10活细胞计数；
5)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105/ml；
6)将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400μl（含5×104细胞）逐滴加入小室；取500μl含10%血
清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。
7)将接种好的细胞放入培养箱，37℃、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。
4.细胞染色及拍照：
1)弃孔内培养基，将小室取出，弃去孔中培养基，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，此过程要求快速完成，避免让小室的
膜过于干燥，将小室置于已加入500ul固定液的培养孔中，在上室中加入200ul固定液，固定5-10分钟左右。
此过程要将保证培养板盖有盖子，以防挥发。
2)弃去孔中固定液，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，将小室置于已加入500ul苏木素染液的培养孔中，上室中加入200ul
固定液，染色10-15min。
3)将小室转移至新的培养孔中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面的细胞。
4)往小室内加入100ulPBS，倒置显微镜观察穿过去的细胞，200×光镜下计数10个视野的侵袭细胞数,取其平均值,以侵袭细胞的
相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。
5)若颜色偏浅，可以置于染色液中重复染色，水洗至适当颜色后即可。
（二）移动实验
1.小室润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化
5-15min，备用。
2.细胞准备：常规培养细胞，用PBS（已灭菌）或无血清培养基洗涤3次后，加入常规量无血清培养基饥饿12h。
3.接种Transwell小室
1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1分钟以内。
2)加入4℃预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），
水平转子4℃、700rpm/min，离心五min；
3)弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释细胞密度大于1.5×105/ml），
轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-RadTC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-RadTC10活细胞计数；
4)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105/ml；
5)将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400μl逐滴加入小室；取500μl含10%血清的培养基沿小室
侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。
6)将接种好的细胞放入培养箱，37℃、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。
4.细胞染色（Giemsa试剂盒）及拍照：
（三）Transwell小室重复利用处理方法
1．拍照结束后，将小室直接放入6孔板/24孔板中，小室上下均加入适量胰酶，使膜浸泡在胰酶中，室温放置过夜（约6h以上）；2．将小室取出，用75%乙醇浸泡5min（可将小室全部没入乙醇中），重复三次，以除去苏木素染色；
3．无菌水漂洗几次以除去残留物质，甩干水后，置于室温自然晾干；
4．再次使用之前，将晾干的小室及所用的细胞板置于超净台紫外下除菌，小室正反面各照射30min。
注：小室可重复利用多次，但在棉签擦拭的时候力度避免过大，以免损伤小室膜；重复使用之前可观察小室膜是否出现裂痕，若出现较多裂痕可停止使用。
