Transwell实验步骤

transwell实验原理及步骤
Transwell实验是一种常见的物理隔离实验，它可以检测细胞分子的通透性，
定量测定细胞的迁移习性。

它具有优异的实验特性，可以在固定的薄膜上完成细胞迁移过程。

因此，Transwell实验实际上可以应用于多种疾病的研究和药物筛选等
研究领域。

Transwell实验是在薄膜上进行细胞迁移特性测定的实验，它的主要步骤分为
三个步骤：准备样品、实验和数据处理。

第一步，准备样品，首先要选择一种不同的膜作为载体，膜的选择取决于要用到的分子的大小；其次，细胞株必须首先分离和培养；最后，加入可能影响细胞迁移的化学物质（如化合物、药物、特定酶或细胞因子）作为实验要素。

第二步，实验阶段，包括将膜放置在实验容器中，并将细胞分离出来放入上腔，用培养液洗刷，细胞从上腔渗透进下腔，移动距离便是细胞迁移距离，借助于荧光染料示踪，通过荧光显微镜观察细胞，进而计算细胞的迁移距离。

第三步，数据处理阶段，则需要统计和分析细胞迁移的定量和分布信息，这就需要使用数据处理软件进行分析与统计，如生物信息学的软件pacbase、minitab等，将细胞的迁移情况进行统计和处理，最终求出迁移距离和数量。

Transwell实验因其快速、高效、无损及准确等特点，已被广泛用于分析细胞
迁移、免疫反应、肿瘤转移、信号转导等生物学过程中分子性能及功能的研究。

一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。

2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

常用0.4、3.0µm。

我们实验室用的是0.4µm。

一、Transwell小室制备1、无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜:用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。

2、有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 µl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不就是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。

个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。

Transwell实验步骤
Transwell实验步骤：
1.matrigel解冻，4°解冻。

（注意：matrigel很容易凝固，时刻放冰
上）
2.按无血清培养基：matrigel=7:1的比例混匀作为胶层（每个小室加
50ul）
3.用ep管混匀后以50ul每孔加入到小室中（从小室中间滴加进去铺
的更均匀），于37°放置30min左右
4.配置上下层工作液，上层（即小室中）200ul，下层500ul。

（上层
为细胞层，以无血清培养基配细胞液；下层为10%血清培养基。

上下层都应加药）注：细胞处理中在离心后需用pbs洗一遍，后用无血清培养基重悬计数。

5.待matrigel凝固后，取出并吸去上清没有凝固的培养基，注意不要
碰坏胶层。

6.将下层工作液加入下层24孔板中，放入小室，注意中间不要有气
泡，加入上层工作液，完成。

7.放置20h左右后取出（各细胞各异），吸去上层并用棉签轻轻擦拭
除去上层细胞，剪下小室底膜置于孔板中或载玻片上（底面朝上放置），加pbs洗一遍，吸去，加入快速瑞姬氏染料，吸去，用pbs 清洗，吸去。

8.观察（也可以在观察前用中性树胶固定）。

一、Transwell小室制备1. ?无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN 的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min使Matrigel聚合成凝胶。

2. ?有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

细胞内吞实验操作步骤 (Transwell)细胞内吞实验是一种常用的实验方法，用于研究细胞对外界物质的摄取过程。

Transwell是一种常用的实验仪器，用于模拟细胞内吞的过程。

以下是细胞内吞实验操作步骤的简要介绍：1. 准备细胞培养物- 从细胞库中选取需要进行实验的细胞系，并进行细胞培养。

- 在适当的培养基中培养细胞，使其达到合适的密度。

2. 准备Transwell装置- 取出Transwell装置，检查是否完好无损。

- 将适当的培养基添加到Transwell的上室和下室中。

3. 细胞接种- 将预先培养好的细胞通过传代方法收集。

- 计算细胞的浓度，根据实验需要进行稀释。

- 将适当浓度的细胞悬液加入Transwell的上室中。

- 将上室和下室之间的孔隙区域密封，避免交叉污染。

4. 培养细胞- 将装有细胞的Transwell装置放入孵化箱中。

- 设置适当的温度、湿度和气体组成以提供最佳的细胞生长条件。

- 将细胞培养在孵化箱中的适当时间，以确保细胞内吞的进行。

5. 固定和染色- 取出细胞培养装置，并将培养液倒掉。

- 用适当的缓冲液进行细胞固定。

- 根据需要选择适当的染色方法，如普鲁士蓝染色、荧光染色等。

6. 观察和分析- 使用显微镜观察固定并染色的细胞。

- 记录细胞内吞的现象和观察到的细胞形态等。

- 根据需要使用图像分析软件对细胞进行图像处理和数据分析。

注意事项：- 在操作过程中，注意细胞的无菌处理，避免细菌或其它污染物的引入。

- 每个步骤都应该严格按照实验室的操作规范进行操作。

- 根据实验需要，可以根据具体情况进行适当的调整和优化。

以上是细胞内吞实验操作步骤的简要介绍，希望能对您的实验有所帮助。

一、Tran swell 小室制备1. 无基质胶Tran swell 小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。

另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min使Matrigel聚合成凝胶。

2. 有基质胶的Tran swell 小室制备Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。

更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。

但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。

这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。

将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。

这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。

常用0.4、3.0µm。

我们实验室用的是0.4µm。

transwell迁移实验步骤
Transwell迁移实验步骤包括：
1. 样品准备：准备细胞悬液，一般细胞浓度为
1×10^6 cell/ml；
2. 把悬液放入Transwell迁移板中，一般每孔放500～1000 μl 悬液；
3. 加入迁移因子，如血清、培养基等；
4. 在上层室内加入诱导因子，如TNF-α等；
5. 将Transwell迁移板放入培养箱，一般温度为37℃，湿度为90%；
6. 培养时间在24～48小时，如果有特殊要求可以适当延长；
7. 收集下层室中的细胞，将其用于测定迁移能力；
8. 细胞迁移数量的检测，一般采用放射免疫测定、流式细胞仪检测；
9. 实验结果分析，计算迁移指数，观察曲线图，分析细胞迁移情况。

;。

transwell实验步骤及⽅法
Transwell实验具体步骤及⽅法
1.取对数⽣长期的细胞，常规消化（可以⽆⾎清饥饿12~24h，去除⾎清对cell
侵袭能⼒的影响）
2.⽤含1%FBS的培养基重悬细胞，调整细胞密度为（2~5）*10 5/ml，细胞要
多⼀点
3.取100ul细胞悬液接种于transwell⼩室的上室，下室加⼊600ul含10%FBS
的培养基（避免⼩室下⾯产⽣⽓泡）
4.培养细胞24h/48h，后取出⼩室置烧杯内涮洗；24孔板中加⼊800ul甲醇/孔。

5.吸⼲上室液体，4%多聚甲醛室温固定10~30min，
另⼀24孔板中加⼊800ul染⾊液/孔
涮洗后，吸⼲上室固定液，移⼊0.1%结晶紫染⾊液，室温染⾊20min （结晶紫：常规⼯作液浓度0.1%）
6.⼩室⽤流动⽔轻轻冲洗浸泡3次进⾏脱⾊染⾊
7.吸⼲上室液体，⽤棉签（棉花扯松⼀点再擦）轻轻擦掉上室底部膜表⾯未迁
移细胞
8.显微镜下随机观察5个视野细胞，并进⾏照相
9.数据处理。

一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。

2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

Transwell实验具体步骤及方法
1.取对数生长期的细胞，常规消化（可以无血清饥饿12~24h，去除血清对cell
侵袭能力的影响）
2.用含1%FBS的培养基重悬细胞，调整细胞密度为（2~5）*10 5/ml，细胞要
多一点
3.取100ul细胞悬液接种于transwell小室的上室，下室加入600ul含10%FBS
的培养基（避免小室下面产生气泡）
4.培养细胞24h/48h，后取出小室置烧杯内涮洗；24孔板中加入800ul甲醇/孔。

5.吸干上室液体，4%多聚甲醛室温固定10~30min，
另一24孔板中加入800ul染色液/孔
涮洗后，吸干上室固定液，移入0.1%结晶紫染色液，室温染色20min （结晶紫：常规工作液浓度0.1%）
6.小室用流动水轻轻冲洗浸泡3次进行脱色染色
7.吸干上室液体，用棉签（棉花扯松一点再擦）轻轻擦掉上室底部膜表面未迁
移细胞
8.显微镜下随机观察5个视野细胞，并进行照相
9.数据处理。

迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。

1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。

1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。

ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。

但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。

ﻫ２。

3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞融合实验操作步骤 (Transwell)本文档旨在提供细胞融合实验操作步骤，以帮助研究人员在实验室中进行Transwell细胞融合实验。

实验材料准备- Transwell细胞培养板- 高血压膜过滤器- 静脉血清- 细胞培养基- 针头（18G）- 自动移液器- 温度恒定的培养箱- 表示细胞数量的显微镜- 光镜实验步骤1. 准备培养基：根据试验需求制备适当的培养基，确保含有必要的营养物质和血清。

2. 细胞应悬浮在含有10％静脉血清的培养基中，以稀释初始细胞浓度至所需浓度。

确保细胞悬浮均匀。

3. 取出Transwell细胞培养板，并将膜过滤器插入上部。

4. 向下部加入适量的培养基，确保液体不超过膜过滤器底部。

5. 使用18G针头在上部加入约50μL的细胞悬浮液。

确保液体在膜过滤器上均匀分布。

6. 将细胞培养板轻轻放入温度恒定的培养箱，并以合适的温度和时长进行培养。

7. 培养结束后，用自动移液器将上部液体移除。

8. 将Transwell细胞培养板放在显微镜下观察细胞融合情况。

9. 使用光镜检查细胞融合效果和细胞存活情况。

注意事项：- 进行实验前，请确保实验仪器设备已经彻底清洁，并且培养基和细胞悬浮液已经准备好。

- 在操作过程中，请注意细胞悬浮液的均匀分布和液体添加的准确性。

- 实验后请及时清理实验台，妥善处置实验废液和废弃物。

以上提供的是Transwell细胞融合实验的基本操作步骤，具体实验参数和条件可根据实际需求进行调整。

请确保在实验过程中遵守实验室安全操作规程，并根据实际情况进行相应的优化和改进。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)迁移实验（cellmigrationassay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤：1材料准备：摄影显微镜，Transwell细胞，孔径8μm。

Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板未涂有胶水（Coster和Corning也常用）。

细胞培养板应与购买的Transwell培养箱相匹配。

基质凝胶，无血清DMEM，（1%胎牛血清）DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可添加20%血清），无菌PBS，棉签，胰蛋白酶，4%聚甲醛固定溶液或甲醇，结晶紫染料（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和过程2.1基质铺胶板：用bd公司的matrigel1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被transwell 小室底部膜的上室面，置37℃30min使matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液① 在制备细胞悬浮液之前，可将细胞从血清饥饿状态下移除12-24小时，以进一步消除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用pbs洗1－2遍），用含bsa的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞① 取细胞悬液100μL加入Transwell培养箱。

②24孔板下室一般加入600μl含20?s的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

Transwell侵袭实验操作步骤
1、实验前一天，将已经分装后的一管Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，Matrigel胶即从固体状态融化为液体状态。

2、包被基底膜：Matrigel基质胶以1：8稀释后包被transwell 小室底部膜的上室面(整个过程注意冰上操作，否则Matrigel在10℃以上即会凝固)，3小时风干。

3、水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50μL 10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

4、常规胰酶消化细胞，PBS洗1-2遍去除血清的影响，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为5*105个/mL。

5、取200μL细胞悬液加入Transwell小室上室，24孔培养板下室内加入600μL 含10% FBS培养基。

注意下层培养液与小室之间不要产生气泡。

6、培养板置于37℃的CO2培养箱中，依据肿瘤细胞侵袭能力而定培养12-48h。

7、取出小室，PBS淋洗2遍，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，在24孔板内4%多聚甲醛(或95%酒精)固定20 min，结晶紫溶液染色15 min。

8、倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数10个视野，取平均值，统计分析。