不同实验中transwell小室的选择和使用

一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。

2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

一、Transwell小室制备1、无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜:用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜:吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。

2、有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 µl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不就是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。

个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。

不同实验中transwell 小室的选择和使用Transwell 小室在细胞实验中很常用,共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验都会用到，但小室的规格有很多种，不同的实验需要用到的小室规格也不同.根据transwell 板的不同，transwell 小室可以分为 6 孔板小室、12 孔板小室和24 孔板小室以及和transwell 皿配套的75 mm 直径的小室；根据孔径的不同,从小孔径到大孔径又分为0。

4μm 规格、3μm 规格、5μm 规格、8μm 规格，不同实验对小室孔径的要求也不一样。

小于3μm 孔径的小室，细胞不会迁移通过，研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,应该选择3μm 以下的孔径。

例如共培养实验和caco —2 细胞转运模型实验。

共培养实验：常用0。

4、34μm，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的影响.caco—2 细胞转运模型:选用0。

44μm 膜，将Caco-2 细胞以约l×10 个/mL,每孔0.5 mL 的密度接种在Transwell 内培养21d 左右，前 1 周隔天换液，1 周后每天换液.在模型建立的同时对其跨膜电阻值及碱性磷酸酶活性进行监测来判断模型是否达到转运实验要求.涉及到细胞迁移的实验：要用5。

0、8。

0、12。

0μm 的小室，这样上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映细胞的趋化能力、迁移能力和侵袭能力。

趋化性实验：细胞 B 对细胞 A 的趋化作用，将细胞 A 种于上室，细胞 B 种于下室,可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的趋化作用；趋化因子对细胞的趋化作用,将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

细胞迁移实验：常用8。

0、12。

0μm 膜，上室种细胞，下室加入FBS 或某些特定的趋化因子,细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。

Transwell小室实验是一种常用于细胞学研究中的实验方法，主要用于研究细胞迁移、侵袭、成血管和细胞-细胞相互作用等细胞生物学现象。

本文将详细介绍Transwell小室实验的原理及其在细胞学研究中的应用。

一、Transwell小室实验原理Transwell小室实验是通过一种特殊的小室装置进行的，该装置由两个分隔的小室组成，上下两个小室之间通过一片具有微孔的多孔膜相连。

这片多孔膜的孔径可以根据实验需要进行选择，常见的孔径有3um、8um等。

在实验过程中，我们将需要观察的细胞或细胞外基质放置在上小室中，而下小室中则向其添加一定浓度的化学物质或药物。

待实验进行一定时间后，我们可以通过上下小室之间的多孔膜来观察细胞的迁移、侵袭或是其他相关现象。

在Transwell小室实验中，我们可以根据实验需要对多孔膜进行功能修饰，比如涂覆胶原蛋白、基质蛋白等物质，或是加入不同浓度的化学刺激物质，以模拟细胞在不同生理环境下的行为。

这种设置能够更真实地反映细胞在体内的生理活动，进一步帮助我们理解细胞的生理与病理过程。

二、Transwell小室实验在细胞学研究中的应用1.细胞迁移和侵袭研究Transwell小室实验广泛应用于细胞迁移和侵袭研究中。

我们可以将需要研究的细胞悬浮在上小室中，然后在下小室中添加诱导因子，比如趋化因子、血浆成分等，通过多孔膜对细胞进行筛选，并观察细胞在多孔膜上迁移扩散的情况。

这种实验能够模拟体内细胞在不同环境中的迁移和侵袭过程，帮助我们更好地理解细胞在肿瘤转移、炎症反应等生理和病理过程中的行为。

2.成血管研究Transwell小室实验也常用于细胞成血管相关的研究。

我们可以在上小室中培养内皮细胞或其他与血管生成相关的细胞，然后在下小室中添加适当的生长因子或细胞因子，观察细胞在多孔膜上形成管状结构。

这种实验方法有助于我们深入了解血管生成的分子机制，并为相关疾病的治疗提供新的思路。

3.细胞-细胞相互作用研究在细胞-细胞相互作用研究中，Transwell小室实验也具有重要的应用价值。

一、Transwell小室制备1. ?无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN 的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min使Matrigel聚合成凝胶。

2. ?有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

一、Tran swell 小室制备1. 无基质胶Tran swell 小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。

另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min使Matrigel聚合成凝胶。

2. 有基质胶的Tran swell 小室制备Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。

如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。

用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。

另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。

2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。

再吸去剩余培养液。

二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。

具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。

个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。

如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。

Transwell实验具体步骤及方法
1.取对数生长期的细胞，常规消化（可以无血清饥饿12~24h，去除血清对cell
侵袭能力的影响）
2.用含1%FBS的培养基重悬细胞，调整细胞密度为（2~5）*10 5/ml，细胞要
多一点
3.取100ul细胞悬液接种于transwell小室的上室，下室加入600ul含10%FBS
的培养基（避免小室下面产生气泡）
4.培养细胞24h/48h，后取出小室置烧杯内涮洗；24孔板中加入800ul甲醇/孔。

5.吸干上室液体，4%多聚甲醛室温固定10~30min，
另一24孔板中加入800ul染色液/孔
涮洗后，吸干上室固定液，移入0.1%结晶紫染色液，室温染色20min （结晶紫：常规工作液浓度0.1%）
6.小室用流动水轻轻冲洗浸泡3次进行脱色染色
7.吸干上室液体，用棉签（棉花扯松一点再擦）轻轻擦掉上室底部膜表面未迁
移细胞
8.显微镜下随机观察5个视野细胞，并进行照相
9.数据处理。

迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。

1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。

1基质胶铺板:用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。

ﻫ２、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。

但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。

ﻫ２。

3接种细胞①取细胞悬液１00µl加入Trａnｓwelｌ小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

Transwell实验原理与操作步骤Transwell实验，也被称为细胞侵袭实验，是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。

其基本原理是将小室放入培养板中，小室内称为上室，培养板内称为下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

上室内添加上层培养液，下室内添加下层培养液，并将研究的细胞种在上室内。

由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。

在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时，可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

在肿瘤细胞侵袭实验中，需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶，用以模仿细胞外基质。

肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质消化了才能进入下室（这与体内情况较为相似）。

最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。

有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。

建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。

Transwell实验的具体操作步骤如下：1.实验前的准备工作：需要提前一天将Matrigel胶（一种人工合成的细胞外基质）从冰箱中取出，放置在冰盒上融化。

同时，将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。

2.基质胶铺板：将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合，然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部，注意要避免产生气泡。

铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟，使Matrigel胶凝固。

3.细胞处理：将需要研究的细胞进行传代或复苏，并用无血清培养基洗涤两次，然后用胰酶消化并计数。

4.接种细胞：将计数好的细胞用无血清培养基重悬，然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中，注意要保证每个小室的细胞数量一致。

5.添加培养液：在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基，上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。

6.培养细胞：将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时，具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。