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第七章植物基因工程

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细胞工程第七章 植物转化受体系统

细胞工程第七章 植物转化受体系统

特点：
(1) 原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能够直 接高效地摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核；
(2) 通过原生质体培养，细胞分裂可形成基因型一致的细胞 克隆，从转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少；
(3) 原生质体转化受体系统易于在相对均匀和稳定 的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定；
选择原则 ：
①同一物种的培养基有雷同性，即同一物种的不同亚种、品种间的基本培养基 类型基本相同；
②同一植物的不同组织器官的基本培养基类型基本相同； ③植物组织培养时所需营养成分与田间栽培有相似性； ④MS培养基是大多数植物的通用培养基； ⑤无机盐的浓度是基本培养基类型的重要因素，应该作为培养基选择的重要参
的抗生素有一定的敏感性；要求抗生素对受体植物 没有严重的毒性；
（5）对农杆菌侵染有敏感性。
第一节 植物基因转化受体系统的类型及其特性
一、愈伤组织再生系统
愈伤组织再生系统是指外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并 通过分化培养获得再生植株的受体系统。
特点：
（1）外植体细胞经历了脱分化和再分化两个过程，具有易 于接受外源基因的能力，转化率较高；
第七章 植物基因转化受体系统
本章所讲内容：
建立植物基因转化受体系统的基本条件； 植物基因转化受体系统的类型及其特性； 建立植物基因转化受体系统的程序及要求； 建立植物基因转化受体系统过程中的常见问
题及解决方案。
概述：
植物基因工程技术：即将目标性状基因分离出来， 构建重组DNA分子导入受体物种中，筛选出获得目 标基因表达后代，培育新品种，这种技术称为转化。
生理上的变化：
结构：茎尖分生细胞较小、结构简单，缺少 具正常功能的输导组织，叶片只有海绵组织， 气孔的保卫细胞功能失调等。

植物基因工程技术及应用

植物基因工程技术及应用
伦理问题：基因工程可能对环境和人类健康产生影响 法规监管：各国对基因工程的监管政策不同需要遵守相关法规 伦理审查：基因工程需要经过伦理审查确保其安全性和伦理性 公众参与：公众对基因工程的态度和参与程度对法规监管有重要影响
Prt Six
植物基因工程的未 来展望与挑战
未来发展方向与趋势
添加标题
基因编辑技术：CRISPR/Cs9等基因编辑技术的应用将更 加广泛
抗病基因 工程：通 过基因工 程技术提 高植物抗 病能力
抗虫基因 工程：通 过基因工 程技术提 高植物抗 虫能力
抗除草剂 基因工程： 通过基因 工程技术 提高植物 抗除草剂 能力
品质改良基因工程
提高作物产量： 通过基因工程 提高作物的产 量如抗虫、抗
病、抗逆等
改善作物品质： 通过基因工程 改善作物的品 质如提高蛋白 质含量、改善
转化方法：包括农杆菌介导转 化、基因枪转化、电穿孔转化 等
转化效率：不同转化方法对转 化效率的影响
基因编辑技术
CRISPR/Cs9技 术：一种高效的 基因编辑技术可 以精确地切割和 替换DN序列
TLEN技术：一 种基于DN识别 蛋白的基因编辑 技术可以精确地 切割和替换DN 序列
ZFN技术：一种 基于锌指蛋白的 基因编辑技术可 以精确地切割和 替换DN序列
Prt One
单击添加章节标题
Prt Two
植物基因工程技术 概述
基因工程的定义
基因工程：通 过人工手段改 变生物的遗传 物质以实现特 定的生物学功
能。
基因工程技术： 利用基因工程 技术对植物进 行遗传改良提 高其抗病性、 抗虫性、抗逆
性等。
基因工程技术 的应用：在农 业生产、环境 保护、医药等 领域具有广泛 的应用前景。

(完整版)植物基因工程

(完整版)植物基因工程
5 Viruses can be used as vectors for whole plants
6 Guns and electric shocks transfer DNA into plant cells
7 Molecular cloning of plant genes
8 Arabidopsis is being used as a model organism for molecular genetic analysis of plants
Ⅳ Application of plant genetic engineering
Ⅴ Biosafety
Genetic Engineering of Plants
Ⅰ Plants are very important for mankind
1) Photosynthesis 2) Food 3) Environmental improvements
Genetic Engineering of Plants
Ⅲ Principles and methods
1 Whole plants can be grown from singe cells
2 Leaf disks are an important target for gene transfபைடு நூலகம்r
4 Reporter genes demonstrate transgene expression in plant tissues
5 Viruses can be used as vectors for whole plants
T-DNA contains: 1) opine systhesis genes 2) iaaM, iaaH—auxins 3) iptZ--phytohormone

第七章植物基因工程

第七章植物基因工程

整株植物的再生性
植物细胞通常不能有效地吸收外源DNA，因 为它们具有纤维素构成的细胞壁。可用纤维素 酶处理植物细胞壁，形成原生质体，待吸收 DNA分子后，经过再生，再通过愈伤组织形成 培育出整株植物。这项技术有一定的局限性， 即大多数单子叶农作物（如谷类作物）很难从 原生质再生出完整细胞。
（四）染色体的多倍体性
①T-DNA（transfer-DNA）
转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物 的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重 要的部分。 左边界 生长素 细胞分裂 基因 素基因 冠瘿碱 合成 右边界
生长素基因: tms、tmr基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促 使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤; iaaM（tms1）和iaaH（tms2）控制由色氨酸产生生长 素吲哚乙酸的生物合成途径.
第七章 植物基因工程
一、高等植物的遗传特性
植物的基本特征
遗传操作的简易性
整株植物的再生性 染色体的多倍体性
植物的基本特征
植 物 低等植物 高等植物
无根、茎、叶等分化器官 合子不经胚直接发育为个体 藻类 地衣
含根、茎、叶、花、果分化器官 合子经胚再发育为个体 苔藓门 蕨类门 裸子门 被子门
遗传操作的简易性
②毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转 移， 进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。 ③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区 段上存在与细菌间接合转移的有关基因， 调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。
④Ori区(origin of replication，复制起 始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我 复制。

第七章 植物基因工程1-4

第七章 植物基因工程1-4

第八章植物基因工程基因工程：在基因的水平上改造生物的技术体系，是指在体外对生物DNA进行剪切、加工，把不同亲本的DNA分子重新组合，并把它引入细胞中表达出具有新的遗传特性的生物这一过程。

植物基因工程：又称植物遗传转化/转基因，是将外源基因转移到植物细胞内，并稳定地整合、表达与遗传的技术。

目的是改变植物性状，培育高产、优质high yield、抗逆新品种/系；或者利用转基因植物/细胞来生产外源基因的表达产物。

植物转基因研究的用途：1）理论研究：如基因功能分析；2）实践应用：如作物遗传改良。

基因工程的基本内容1）目的基因的分离；2）目的基因与载体连接；3）重组分子转入寄主细胞并繁殖；4）阳性克隆的筛选；5）从阳性克隆中提取已扩增的目的基因；6）目的基因克隆到表达载体，导入寄主细胞并表达。

植物基因工程的一般流程目的基因的分离→表达载体的构建→植物遗传转化→转化体的筛选、鉴定与植株再生→转基因植物的分子检测→转基因植物的表型鉴定→转基因植物的遗传分析、田间试验经遗传改良的生物, 统称：genetically modified organism (GMO)；Genetically engineered organism (GEO)。

转基因植物(transgenic plants), 又称：genetically modified plant (GMP)；genetically modified crop (GMC)。

第一节目的基因的分离目的基因：已经或准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段，称为~。

可能是:1）全长基因：外显子+内含子+转录启动区+终止区；2）全长cDNA：UTR区+编码区（ORF）；3）开放读框/编码区（ORF，CDS）；信使核糖核酸(mRNA)分子中能翻译成多肽的那部分序列。

来自DNA分子中的外显子。

4）一个完整的操纵子或基因簇；5）只含启动子或终止子等元件的DNA 片段。

植物基因工程

植物基因工程

转化体的鉴定
转基因植物的鉴定主要集中在DNA、RNA和目的蛋白三个层面上。 1.DNA水平
southern 杂交；斑点杂交（dot blotting）:是在southern 杂交基础上发展而来的
快速检测特异核酸的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器 上的核酸样品直接转移到杂交膜上，然后再按southern 杂交法进行杂交；PCR。 2. RNA水平 Northern 杂交；RT-PCR（逆转录PCR）：先将mRNA转录成cDNA，再设计一对 引物扩增杂交分子。 3.蛋白质水平 western 杂交,elisa等。
• 后来的研究表明，在Ti质粒中，只有一小
Ti质粒的构成 Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、 Onc区和Ori区共4个区段。 1 、Vir区(毒性区) 在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基 因。表达产物激活T-DNA向植物细 胞转移，使植物引发肿瘤。 2、 Onc区 含有农杆菌之间接合转移有关的基
•构建植物基因Biblioteka 程载体 •将外源基因导入植物受体 •转基因植物的鉴定
1.目的基因的分离和克隆
已知基因的获得： • 化学合成法 • PCA显示差异技术筛选差异表达基因， • 差异蛋白谱表达技术筛选功能基因
2.构建植物基因工程的载体
导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选 择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。 理想报告基因的基本要求： 受体细胞不存在相应的内源等位基因的活性。 它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。 具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。
最常用的报告基因
ß -葡萄糖苷酸酶基因（gus）; 氯霉素乙酰转移酶基因； 荧光素酶基因; 分泌型碱性磷酸酶 ; 荧光蛋白家族

植物基因工程

植物基因工程
Plant Gene Engineering
植物基因工程的诞生

一、传统的育种方法有其局限的 一面。 二、植物基因工程的诞生是与植 物分子生物学的发展密不可分的

第一节 植物基因工程的发展


1 国外转基因植物产业化现状
自从 1983年首次获得转基因植物后，至今 已有35科120多种植物转基因获得成功。 1986年首批转基因植物被批准进入田间试验， 至今国际上已有30个国家批准数千例转基因 植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多 种。 种植转基因植物的国家从 1992年的1个增长 到1996年的6个，1998年9个，1999年进一 步扩大到12个国家。全球转基因植物的种植 面积1996年仅为170万亩，1997年为1100 万亩，1998年增长到2780万亩，1999年又 比1998年增长44%，达到3990万亩。




4．非生物胁迫抗性基因
重金属抗性基因 、抗盐基因 、抗冻基因 、 抗氧化胁迫基因


5．产物质量修饰基因
改变脂肪酸成分的基因 、改变氨基酸成分 的基因 、延迟果实成熟期的基因


6．其它性状基因
控制多羟基丁酸形成的基因 、雄性不育 (male sterility)基因 、抗体基因
第三节 植物基因转移的病毒载 体
冠瘿瘤的形成
冠瘿细胞的重要特性

植物激素自主的生长能力；在它 的细胞壁上有若干特异性的抗原 位点；其细胞壁的果胶部分的甲 基化程度也要比正常细胞高得多； 冠瘿组织嫁接到健康植株上，后 者便会诱发重新形成冠瘿瘤。
三.Ti质粒的遗传特性


(1)冠瘿瘤诱发之遗传本质
参与Ti质粒诱发冠瘿瘤的有三种遗传成分。 头一种是T-DNA，它是Ti质粒基因组中被转 移并整合到寄主植物细胞染色体上去的特定 DNA片段。第二种是vir基因，位于Ti质粒 DNA上，其编码产物为反式作用蛋白质，是 植物细胞转化的必要因子。第三种是间接参 与植物细胞转化的基因，由根瘤土壤杆菌的 染色体基因组编码的，其表达产物的功能是 使细菌细胞结合到感染植物的创伤部位

植物基因工程课件ppt


微管注射法
利用显微操作技术将外源 基因直接注入植物细胞， 实现基因转移。
基因表达与调控
启动子选择
选择合适的启动子，以调 控外源基因在植物中的表 达水平。
转录因子应用
利用转录因子调控植物基 因的表达，实现植物性状 的改进。
表观遗传修饰
通过DNA甲基化、组蛋白 修饰等手段，调控植物基 因的表达。
基因编辑技术
植物基因工程课件
汇报人： 202X-12-30
目录
• 植物基因工程简介 • 植物基因工程基本技术 • 植物基因工程应用 • 植物基因工程面临的挑战与前景 • 案例分析
01
植物基因工程简介
Chapter
定义与特点
定义
植物基因工程是利用重组DNA技术 对植物基因进行操作和修饰的一门科 学。
特点
具有高度精确性和可操作性，可以实 现植物性状的定向改进，提高抗逆性 、产量和品质等。
转基因玉米的研发与应用
总结词
转基因玉米是利用基因工程技术改进玉米性状，提高产量、抗逆性和品质的玉米新品种 。
详细描写
转基因玉米的研发主要针对抗虫、抗病、抗旱等性状进行改进。通过导入外源抗虫基因 和植酸酶基因等，转基因玉米表现出较好的抗虫性和产量。同时，转基因玉米还具有较 好的耐旱、耐盐碱等特性，能够适应不同环境条件下的生长。转基因玉米的应用提高了
安全性问题
对生态环境的影响
转基因植物可能成为入侵物种，破坏生态平衡。
对非目标生物的影响
转基因植物可能产生抗药性，影响农药效果。
食品安全问题
转基因食品的安全性尚未得到充分验证，可能对人体健康产生潜 伏风险。
法规与伦理问题
国际法规不统一
各国对转基因技术的法规和监管标准不统一，导致跨国合作困难。

7.第七章、植物基因工程


2
二,植物基因工程的DNA转系统 植物基因工程的DNA转系统 DNA
植物基因工程的转化系统主要有: 植物基因工程的转化系统主要有: Ti质粒载体转化系统; Ti质粒载体转化系统; 质粒载体转化系统 病毒载体感染系统; 病毒载体感染系统; 物理转化系统; 物理转化系统; 植物原生质体再生
2010-6-10
3
(一)Ti质粒载体转化系统 Ti质粒载体转化系统
2010-6-10
4
1.Ti质粒的结构 1.Ti质粒的结构
Ti质粒有200-800kb(见图1 Ti质粒有200-800kb(见图1.),分TDNA区和vir区和有机碱代谢区. 质粒有200 kb TDNA区和vir区和有机碱代谢区. 区和vir区和有机碱代谢区 TDNA区 12-24kb),分三部分: TDNA区(12-24kb),分三部分: kb) (1).Tms区:由iaaH和iaaM两个基因组成,控制由色氨酸合成生长素的途径; Tms区 iaaH和iaaM两个基因组成,控制由色氨酸合成生长素的途径; 两个基因组成 Tmr区 iptZ基因控制 控制由异戊二烯焦磷酸和AMP 基因控制, AMP合成分裂素的反 (2).Tmr区:由iptZ基因控制,控制由异戊二烯焦磷酸和AMP合成分裂素的反 应; (3).Tmt区:控制冠缨碱(opines)的合成,有三种:瘴鱼碱(octopine); Tmt区 控制冠缨碱(opines)的合成,有三种:瘴鱼碱(octopine) 胭脂碱(Nopaline) 农杆碱(Agropine) 因此分成三种Ti质粒. Ti质粒 胭脂碱(Nopaline);农杆碱(Agropine).因此分成三种Ti质粒. 在TDNA区的两端有25bp的长末端重复区. TDNA区的两端有25bp的长末端重复区. 区的两端有25bp的长末端重复区 Vir区 35kb) 负责Ti质粒的转化和整合. Vir区(35kb),负责Ti质粒的转化和整合. kb Ti质粒的转化和整合 冠缨碱代谢基因,主要是分解冠缨碱,分解产物可作为营养成分. 冠缨碱代谢基因,主要是分解冠缨碱,分解产物可作为营养成分. 复制位点:负责Ti质粒的复制. 复制位点:负责Ti质粒的复制. Ti质粒的复制

植物基因工程ppt课件

1.5.1 Vir基因的诱导 1.5.2 VirA和VirG被构造性表达 1.5.3 T－DNA的加工及转移 1.5.4 T-DNA链整合植物基因组
片段，占Ti 的7-15％，两边有23bp的定向 反复序列。
章鱼碱型的T-DNA区分为两部分，左区 〔TL-DNA〕为13kb的单拷贝序列，是诱发 和维持肿瘤所必需的。右区〔TR-DNA〕为 7kb的多拷贝序列。
T-DNA通常较完好的且序列不改动地被 整合到植物基因组中。
1.3 T－DNA
1.3.2 T-DNA携带的遗传信息 〔1〕致瘤基因：用于转化植物细胞的基因，
1.2 Ti质粒
1.2.2 Ti质粒的物理图谱 物理图谱：限制性内切酶酶切片段在Ti-DNA
上的陈列顺序。
Ti物理图谱构建：经限制性内切酶处置之后 的Ti质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳作片段分 别，便可显示出有20多条大小不同的DNA 酶切片段。然后将这些酶切片段进展分子 杂交分析，测定顺序，再陈列成完好的物 理图。
1.1植物冠瘿瘤——植物的一种癌症
1.1冠瘿瘤
植物与人一样，可以产生各种各样的瘤和癌。其中一类瘤 被叫作瘿，瘿的种类很多。引起瘿的要素有：受伤、昆虫、 病毒、细菌和特定的基因组织表达等。人们最感兴趣的瘿 是冠瘿瘤。
1.1.1冠瘿瘤的原因 由根癌农杆菌〔Agrobacterium tumefaciens〕[属根瘤菌科〔Rhizobiaceat〕]对植物的侵 染而引起。
植物基因工程
1.根癌农杆菌与植物转化的分子生物学 2.植物基因工程中Ti载体及其构建 3.植物基因转化受体系统 4.根癌农杆菌转化程序 5.植物病毒介导的基因转化
1.根癌农杆菌与植物转化的分子生物学
1.1 植物冠瘿瘤－植物的一种癌症 1.2 Ti质粒 1.3 T－DNA 1.4 Vir区的基因构造与功能 1.5 农杆菌Ti质粒基因转化机理
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必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病
毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种 很有潜力的植物病毒载体。
TGMV A 链
转染植物组
TGMV dsDNA
体外复制 用目的基因和标记基因取代病毒包衣基因
织 双生病毒家
族成员蕃茄 金花叶病毒 （ TGMV ） 克隆表达载 体的构建程 序
农杆菌筛选标记
（6）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。
(3).Ti质粒转化的对象 裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶 植物（玉米 (4). Ti质粒作为载体的可能性 能够自发地整合到植物的染色体上。 能转化多种植物。 强启动子 T-DNA的opine合成酶基因上有一个强 启动子，能启动外源基因的表达。
（5）Ti 质粒致瘤的分子机制： 损伤的植物根部会分 泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰 丁香酸，它们能诱导Ti质粒 上的vir基因以及根瘤菌染 色体上的一个操纵子表达。 vir基因产物将Ti质粒上的 T-DNA单链切下，而根瘤菌 染色体上的操纵子表达产物 则与单链T-DNA结合形成复 合物，转化植物根部细胞。
pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同 pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得 到抗卡那霉素性状。 外源基因
插入
Kanr pBR322
转化
抗卡那霉素 卡那霉素筛选 土壤农杆菌 的土壤农杆菌 pBR322与 pGV3850重组 含pGV3850 感染 外源基因 胭脂碱筛选 植物组织 表达鉴定 整合到
很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以 多倍体的形式存在。大约三分之二的禾本科植物 呈多倍体型，其染色体数目范围从24至144不等。 这种多倍体植物在组织培养过程中呈现出较高的 遗传不稳定性，导致体细胞变异
高等植物基因工程的发展历程
1983 年美国和比利时首次将外源基因导入烟草和胡萝卜 1994 年世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市 1995 年转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国投入生产 2000 年美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆 迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48 个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马 铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、 油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜 、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子 、梨、苹果、葡萄等。
三、高等植物的基因转移系统
Ti 质粒介导的整合转化程序
植物病毒介导的转染程序 植物细胞的直接转化程序
植物原生质体的再生程
序
（一）Ti 质粒介导的整合转化程序 Ti 质粒的结构与功能
几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部
常常会形成根瘤（冠瘿瘤），这是由于植物根部被一
种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens
②毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转 移， 进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。 ③Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区 段上存在与细菌间接合转移的有关基因， 调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。
④Ori区(origin of replication，复制起 始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我 复制。
Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）
②双元载体的转化 1）基因插入 转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都 在大肠杆菌里操作。 2）帮助质粒（ helper plasmid） 受体农杆菌内要求带有整套vir基因 （但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助 质粒”提供vir产物。 Vir产物使双元载体上的T-DNA左右 边界及其外源基因转入到植物细胞， 并整合到植物染色体上。
换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗
粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整
株植物。
植物病毒介导的转染程序 转染植物组织
植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA
病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含 有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞 中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因； B链编码 另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。 A、 B两条链
E.coli 左 外源基因 右 双元载体 转化
农杆菌 Vir 帮助质粒
左 外源基因 右 感染植物
进入植物细胞核， 整合，表达
Vir 左 外源基因 右
农杆菌
双元系统的特点
• 双元系统的特点是两个质粒即穿梭质粒和Ti质粒，在接合 后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。 • 穿梭质粒编码植物选择标记，表达信号，并具有位于两个 T-DNA边界序列之间的用于外源基因的多克隆位点。 • 双元系统中的农杆菌质粒是一个经过改造的Ti质粒，具有 Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边 界序列。 • 接合后，两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌 细胞中。当农杆菌感染受伤的植物时，Ti质粒上的Vir基 因与穿梭质粒上的左右边界序列发生相互作用，从而将 T-DNA转移进入植物基因组。
(2). 农杆菌的感染和生存
①第一步:植物受伤
植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙 酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导 Ti质粒上的毒性基因表达。
②第二步 感染植物 脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常 在茎的基部）。 第三步 毒性基因（vir）表达 virA、virG、virD、virB ④第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植 物细胞核里，整合到植物基因组中。 ⑤第五步 诱导冠瘿瘤 T-DNA上的产物催化产生过量的生长 素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。
（8）、Ti 质粒的改造
除去生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因； 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）； 除去 Ti 质粒的其它非必需序列，最大限度地缩短长度；
安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克 隆操作； 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的
第七章 植物基因工程
一、高等植物的遗传特性
植物的基本特征
遗传操作的简易性
整株植物的再生性 染色体的多倍体性
植物的基本特征
植 物 低等植物 高等植物
无根、茎、叶等分化器官 合子不经胚直接发育为个体 藻类 地衣
含根、茎、叶、花、果分化器官 合子经胚再发育为个体 苔藓门 蕨类门 裸子门 被子门
遗传操作的简易性
①T-DNA（transfer-DNA）
转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物 的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重 要的部分。 左边界 生长素 细胞分裂 基因 素基因 冠瘿碱 合成 右边界
生长素基因: tms、tmr基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促 使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤 ; iaaM（tms1）和iaaH（tms2）控制由色氨酸产生生长 素吲哚乙酸的生物合成途径.
）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质 粒 Ti质粒（Tumor-inducing plasmid）介导的，又 称肿瘤诱导质粒。
（1） Ti 质粒的图谱区
整个质粒160 -240 kb T-DNA区、Vir区、 Con区、Ori区 其中T-DNA 12 -24 kb tms的编码产物负责： 合成吲哚乙酸 tmr的编码产物负责： 合成植物分裂素 tmt的编码产物负责： 合成氨基酸衍生物冠瘿 碱
染色体上
转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物
共 整 合 转ectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制 起点，是个穿梭载体。 ①双元载体的结构 Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢 基因、vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（<10kb）
tmt 基因编码产物催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿 碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长 必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。是农杆 菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利 用冠瘿碱。 在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界 (left border, LB)和右边界(right border, RB) 是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程 具有重要意义。
（6）T-DNA的染 色体整合机制
(7). 天然Ti质粒作载体的缺点
①野生型Ti 分子大（200kb）操作起来十分麻烦； ②各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的 酶切位点很少；
③tms和tmr 基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生 冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；
④冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨 酸，直接 影响转基因植物细胞的生长代谢； ⑤无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。
② 选择标记
1）脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间 载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr） 基因。 2）最终受体植物的选择标记
卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉 素对植物有剧毒！） 位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基 因（nos）。
③ 外源基因插入 pGV3850的过程
转染植物细胞原生质体 以双链 DNA 病毒花椰菜花斑病毒（ CaMV
）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，
换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗
粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整
株植物。
植物病毒介导的转染程序
转染植物细胞原生质 体 以双链 DNA 病毒花椰菜花斑病毒（ CaMV
）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，
• 插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含 有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感 染植物细胞。 • 与共整合系统所不同的是，含外源基因的 质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。 农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号 启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒 的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。