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8第八章 基因工程与基因体外表达

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基因工程与体外表达

基因工程与体外表达

的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。
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2. DNA聚合酶Ⅰ大片段
DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。
Published by AAAS
Synthetic Genome Brings New Life to Bacterium (2010/5/20)
E. Pennisi Science 328, 958-959 (2010)
Life re-created. Blue colonies (top) indicate a successfully transplanted genome, with selfreplicating bacteria revealed in an electron micrograph.
2
Genetically modified crops
3
E. Stokstad Science 328, 295-a (2010) (2010)
Going green. Rather than plowing, farmers can control weeds by spraying biotech crops with herbicides, which lessens soil erosion and reduces fuel costs.
5. 几个小时之内，受体细菌内原 有DNA的全部消失，人造细胞不 断繁殖。新的生命诞生了。
6
第一节 基因克隆的工具酶
一、限制性核酸内切酶

高中生物基因工程

高中生物基因工程

页脚内容1
4.4基因工程的基本内容
是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复
制、转录、翻译表达的操作，产生出人类所需要的基因产物或创建新的生物类型。

在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，属于基因重组。

定向改造生物的性状。

基因工程
基本工作用 限制
性核酸能识别特定脱氧核糖核苷酸序列 从特定部位的两个核苷酸之间切开 原理 催化磷酸二酯键断裂 结果 形成黏性末端、平末端 用途 切割目的基因和运载体（基因工程） 保护自身细胞原有的遗传信息 D N
A
连
作用 原理 结果 用途 催化磷酸二酯键形成 连接DNA 片段 获得重组DNA 分子 构建基因表达载体（基因工程）
基因修复（原核微生物细胞） BamH I EcoR I Hae III
页脚内容2
质粒 DNA 连接酶酶 目的基因 DNA
获取DNA
获取质粒 细菌 质粒
DNA 用同一种限制性内切酶切割 重组质粒
细胞 目的基因 将目的基因导入受体细胞 DNA 重组质粒 细胞增殖 目的基因产物
将目的基因导入受体细胞 目的基因与运载体结合 提取目的基因 目的基因的检测和表达 基本步骤
页脚内容3。

5基因工程与体外表达

5基因工程与体外表达
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葡聚糖（ （三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法 葡聚糖 ） 外源DNA或重组质粒 或重组质粒DNA与DEAE葡聚 外源 或重组质粒 与 葡聚 糖混合， 糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学 葡聚糖带有大量正电荷的化学 基团，可与 中带负电荷磷酸基团结合， 基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并 中带负电荷磷酸基团结合 粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源 粘附于细胞表面， DNA进入细胞。此法简单、快速、有效，常用 进入细胞。此法简单、快速、有效， 进入细胞 于外源基因的短暂表达研究。 于外源基因的短暂表达研究。
34
二、表达载体 (一) 原核表达载体 一 表达载体中含有复制起始位点、 表达载体中含有复制起始位点、抗性 基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结 合位点和转录终止信号. 合位点和转录终止信号
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(二) 真核表达载体 二
载体中含有原核复制起始位点、 载体中含有原核复制起始位点、抗生素 抗性基因、多克隆位点。 抗性基因、多克隆位点。还含有真核表达 元件,包括启动子 增强子和poly (A) 加尾 包括启动子、 元件 包括启动子、增强子和 信号。 信号。
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2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 聚合酶Ⅰ 聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of 聚合酶Ⅰ大片段 聚合酶 DNA polymerase I)为DNA聚合酶 用枯草杆菌 聚合酶I用枯草杆菌 为 聚合酶 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 裂解后产生的大片段， 蛋白酶 裂解后产生的大片段 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 片段（ 段也称为 片段 ）。
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第十三章-基因工程与基因体外表达

第十三章-基因工程与基因体外表达

第十三章基因工程与基因体外表达第一节基因克隆一．限制性核酸内切酶二．基因克隆中具有不同功能的工具酶第二节基因克隆中特定的DNA载体一．常用克隆载体（质粒和病毒）二．表达载体将外源基因带入宿主并进行表达第三节基因克隆的过程一．获取目的基因二．选择和准备载体三．DNA片段的连接四．重组DNA导入宿主细胞进行扩增五．筛选与鉴定第四节真核细胞基因转染一．真核细胞转染的方法与原理二．转染细胞利用抗性标记进行筛选第五节利用重组DNA技术对基因进行改造一．对特定基因的定点诱变二．利用基因定点诱变技术改变基因工程蛋白的特性第六节克隆基因在适当的宿主细胞表达一．大肠杆菌表达系统二．哺乳动物细胞外源基因的表达三．其他宿主细胞中也表达制备真核蛋白第七节电子克隆本章重点:掌握：DNA克隆概念，限制性内切酶的定义及其特点，基因载体的种类。

重组DNA技术的基本过程，目的基因获取的方法，外源基因与载体的连接方式，重组DNA分子导入受体菌的方式，重组体筛选的方法。

熟悉：基因组DNA文库和cDNA文库的概念，目的基因表达体系的种类及其特点了解：自然界基因转移的方式：接合作用、转化及转导作用、转座；重组有两种类型，即位点特异性的重组和同源重组本章难点两种类型基因重组的机理；限制性内切酶的作用特点，基因载体的种类；重组DNA技术的基本环节中，目的基因的获取方法，外源基因与载体连接的方法，重组DNA导入受体菌的方法，重组体的筛选方法，以及原核和真核表达体系的优缺点比较核心词：DNA重组基因克隆载体宿主细胞基本概念：DNA重组（DNA recombination）：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。

基因克隆（gene cloning）：主要是进行制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制，扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝的过程。

基因工程（genetic engineering）：基因克隆后，利用克隆基因表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程。

分生总结

分生总结

分子生物学总结第二章基因与基因组基因:合成有功能的蛋白质或RNA所必须的全部DNA（除部分RNA病毒外），即一个基因不仅包括编码蛋白质或RNA的核酸序列，还应包括为保证转录所必须的调控序列。

基因组:细胞或生物体中一套完整单倍体的遗传物质的总和。

真核基因结构:分散排布，基因间被一些不含编码信息的序列分开。

原核基因组:1.基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。

2.基因组中只有一个复制起点，具有操纵子结构。

3.编码序列一般不会重叠。

4.编码区非编码区约各占一半。

5.基因组中重复序列很少。

6.具有编码同工酶的同基因。

7.细菌基因组中存在着可以动的DNA序列，包括插入序列和转座子。

8.在DNA分子中具有多种功能的识别区域（如复制起始区、复制终止区、转录启动区和终止区等）。

质粒:独立于许多细菌及某些真核细胞（酵母等）染色体外共价闭合环状分子，是能独立复制的最小遗传单位。

质粒的特性:（1）能在细胞内自主复制。

但不同质粒对宿主细胞的复制系统利用程度不同。

（2）质粒的不相容性。

具有相同复制系统的质粒不能共存于同一个细胞内。

（3）质粒的转移性。

有些质粒可以通过细菌接合作用在细菌细胞间传递。

转座因子:能够在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。

（1）插入序列（2）转座子（3）可转座噬菌体等真核基因组:1.有一定的染色体数目。

2.远大于原核基因组，结构复杂，基因数庞大。

3.转录产物多为单顺反子。

4.存在大量重复序列。

5.非编码序列远多于编码序列。

6.大部分基因不连续。

7.功能相关的基因串联在一起，构成基因家族。

基因家族:核苷酸序列或编码产物的结构上具有一定程度同源性的一组基因。

（1）各基因核苷酸序列相同；（2）各核苷酸序列高度同源；（3）各基因编码的蛋白质高度同源。

病毒基因组:1.不同病毒基因组大小相差较大。

2.可以由DNA组成，也可以由RNA组成。

3.除逆转录病毒外，通常为单倍体基因组。

4.有的病毒基因组是连续的，有的分节段。

基因工程与体外表达

基因工程与体外表达

通过融合标签、调节表达条件等方法解决产物不稳定性和聚集问题。
发展前景和研究方向
1. 开发更高效的表达系统 2. 研究蛋白质折叠和组装机制 3. 优化蛋白质后翻译修饰 4. 应用多维组学技术解析产物结构和功能
蛋白质生产
体外表达可用于大量制备重组蛋白，用于医药和工业领域。
药物筛选和特异性抗体制备
体外表达可以用于药物筛选和特异性抗体的制备，为疾病治疗和诊断提供重要工具。
பைடு நூலகம்
常见的基因工程表达系统
大肠杆菌
是最常用的表达系统之一，具 有易操作、高表达的优点。
酵母
常用于表达复杂蛋白和进行药 物筛选。
哺乳动物细胞
可用于表达大型蛋白和进行临 床前研究。
体外表达系统的优缺点
1 优点
高效、可扩展、质量可控、表达产物天然结构和活性。
2 缺点
特异性低、成本高、难以表达复杂蛋白、不适用于大规模生产。
体外表达中的关键因素和挑战
1
选择合适宿主细胞
不同细胞具有不同的表达能力、转化效率和产量。
2
优化表达系统
包括选择合适的启动子、改进转染技术和优化培养条件。
3
克服产物聚集和稳定性问题
基因工程与体外表达
基因工程是利用分子生物学和基因组学的知识进行人为干预的技术。体外表 达是将外源基因导入宿主细胞中，通过细胞内机制使该基因产生表达产物。
基因工程的原理和技术
• DNA重组技术 • 质粒构建和转染技术 • CRISPR基因编辑技术 • 基因递送系统
体外表达的意义和应用
研究基因功能
通过体外表达，可以探究特定基因的功能和作用机制。

基因工程与体外表达_1828

是一类能识别和切割DNA分子中特定碱基顺 序的核酸水解酶 命名:以限制性内切酶来源的微生物学名进行命 名。通常第一字母（大、斜）代表该酶的微生 物属名；第二三字母（小、斜）代表微生物的 种名；第四个字母代表寄主菌的株或型；
限制性核酸内切酶的分类
Ⅰ类：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两 种功能，但识别、切割位点不一致；
Bam HⅠ
5`
GGATCC
3`
3`
CCTAGG
5`
3、产生3`端突出的粘性末端
SacⅠ
5`
GAGCTC
3`
3`
CTCGAG
5`
少数有特殊性质的Ⅱ型酶
同功异源酶
来源不同的限制酶，识别顺序相同，切割位点可以相 同也可以不同，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
Kpn Ⅰ
GGATCC CCTAGG
GGTACC CCATGG
1. 质粒 (plasmid)
质粒是存在于细胞 染色体外的小型双链 DNA分子,2-200Kb之 间.本身含有复制功能 的遗传结构,能在宿主 细胞独立自主进行复制, 并在细胞分裂时,保持 恒定地传给子代细胞.
特点
能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,
会赋予宿主细胞一些遗传性状。
缺点:该载体一般只能接受小于15kb的外源DNA片段.插入 过大,会导致重组体扩增减慢,甚至插入片段先进丢失.
① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
基因克隆需要特定DNA载体
载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞，进行扩增和表达 的工具。其本质是DNA。用于克隆和扩增特定的DNA片段的 载体称克隆载体，用于表达外源基因的称为表达载体。 载体应具备以下特征： 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复 制。 2. 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3. 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子 是否进入宿主细胞

(工程建筑套表)八章基因工程与体外表达

（工程建筑套表）八章基因工程与体外表达中南大学生物科学和技术学院分子生物学研究中心教案授课科目:医学分子生物学授课内容:基因工程和体外表达授课对象：医学七年制、八年制授课时数：6学时授课教师：曾海涛授课地点：授课时间：授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材）胡维新主编，北京：科学出版社，2007，第壹版第八章基因工程和体外表达壹、目的要求：掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。

熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概念和特点；定点诱变技术原理。

了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。

二、讲授重点：基因克隆的基本过程。

三、讲授难点：α－互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。

四、教学方法：多媒体教学五、教具：多媒体课件六、讲授内容：第壹节基因工程中的工具酶壹、限制性核酸内切酶（restrictionenzyme）限制性核酸内切酶是基因克隆中最重要的工具酶，主要从原核细胞中提取。

它是壹种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别且且裂解磷酸二酯键。

1．限制性核酸内切酶的分类Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用。

这种酶在非特异性位点,通常在识别位点下游100到1000bp处切割DNA。

Ⅱ型酶能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。

Ⅲ型酶和Ⅰ型酶壹样，具有限制和修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。

2．限制性内切酶的命名EcoRⅠE代表Escherichia属co代表coli种R代表RY13株3．限制性内切酶的识别和切割位点通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ粘性末端（stickyend）。

如EcoRⅠ切割后产生5ˊ粘性末端.PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端.有壹些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Bluntend）,如SmaⅠ.二、其他常用的工具酶1.DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseI)有聚合酶活性,3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性,5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。

基因表达(基因工程课件)

目的蛋白质稳定性高。
目的蛋白质易于分离: 利用亲和层析技术，可以快速 获得纯度较高的融合蛋白。
目的蛋白质表达率高: 与受体蛋白质共用一套表达元件。 目的蛋白质溶解性好：融合蛋白质在胞内形成良好的空
间构象，且大多具有水溶性。 目的蛋白质需要回收：融合蛋白质需要裂解和进一步
分离，才能获得目的蛋白。
目的基因表达
CONTENTS
目 录
01 基因表达载概体念的 概 念 、 种 类
02 基因表达载和体调的控特条点件 、 功 能
03
原核与真质核粒生物基因表达的主要差异
04
基因表达过程
05
影响外源基因表达的因素
03
蛋白质的表达形式
基因表达：指基因携带的遗传信息，经过 转录、翻译、加工修饰等复杂过程，产生 具有生物学功能的蛋白质过程。
mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。
原核生物肽链合成的延长：
1.进位: 氨基酰-tRNA结合到 核糖体A位。
氨基酸2
氨基酸1
2.成肽:转肽酶催化，P位上起 始氨基酰-tRNA上的氨基酸 与A位上氨基酰-tRNA的氨基 形成肽键。
CA A G G A
ACUAGGUUCCUGCUAG
3.转位：转位酶催化，A位的 肽酰-tRNA移入P位。
转录延长：
启动子清除，σ亚基脱落， RNA聚合酶核心酶变构，与 模板结合松弛，沿着DNA模 板前移，在核心酶作用下 NTP不断聚合，RNA链不断 延长。
核心酶
β ωα
α
β’
全酶 σ
原核生物：在同一DNA模板上，有多个转录同时进行（羽毛
状现象），转录尚未完成，翻译已在进行。
真核生物：转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜

基因工程与基因体外表达培训课件


➢ 技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆）
细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
路漫漫其悠远
➢DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的 DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA 分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细 胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提 取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。
H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)
1997年,动物克隆: 克隆羊多莉 2001年，人类基因组计划
路漫漫其悠远
一、重组DNA技术相关概念
（一） DNA克隆
➢ 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。
➢ 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
路漫漫其悠远
GGATCC CCTAGG
路漫漫其悠远
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
路漫漫其悠远
GCCTAG+ GATCGC 粘端切口
➢同功异源酶：
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
路漫漫其悠远
➢ 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等。
➢ 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
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第四节 真核细胞转染
一、真核细胞转染的方法与基本原理
（一）磷酸钙沉淀法（calcium phosphate co-precipitation）
使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙 混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中， 使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细 胞摄取这些颗粒。
对一段特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则 切点数多，产生的片段小；而识别序列碱基对多的， 则切点数少，产生的片段大。
19:26
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二、其他常用的工具酶
1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I)
● 聚合酶活性 ● 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 ● 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
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（二）电穿孔法（electroporation）
将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯 中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多 小孔，使外源DNA能进入宿主细胞。
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（三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法
外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚 糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的 化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团 结合，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞 过程促进外源DNA进入细胞。
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基因工程是指在体外对DNA分子按 照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和 重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而 能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产 物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究 基因表达的调节因子，以及研究基因的功 能等。
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5
第一节 基因克隆的工具酶
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第三节 基因克隆的基本过程
基因克隆主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞 ④ DNA重组体的筛选和鉴定 ⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究
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一）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
end）。少数酶沿对称轴切断DNA，产生 平端或钝端（blunt end）。
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EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端：
5 ́-GAATTC-3’ 3 ́-CTTAAG-5’
5 ́-G
AATTC-3 ́
3 ́-CTTAA
G-5 ́
PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：
5 ́ -CTGCAG-3 ́ 3 ́ -GACGTC-5 ́
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2. DNA聚合酶Ⅰ大片段
(large fragment of DNA polymerase I)
DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin) 裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow 片段（Klenow fragment）。
病毒或噬菌体侵入宿主细胞后，整合入宿主细胞的 基因组中；
生殖细胞在减数分裂过程中姊妹染色体之间的互联 与交换；
细胞受到物理、化学因素的刺激后，DNA断裂、重 组。如：t(14;18)染色体易位。
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3
基因工程 (gene engineering) 基因操作 (gene manipulation) 分子克隆 (molecular cloning) 基因克隆 (gene cloning) DNA重组(recombinant DNA)
（四）平端连接
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四、外源DNA导入宿主细胞
（一）转化（transformation） （二）感染（infection） （三）转染（transfection）
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五、目的基因的筛选和鉴定
外源基因导入宿主细胞后，筛选含有 目的基因的阳性克隆并加以扩增。
所用的方法主要有遗传学方法、免疫 学方法、核酸杂交法、PCR等。
（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。
（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主 细胞进行选择，如抗生素抗性基因， β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。
（3）具有多个限制性内切酶的单一位点（多 克隆位点），便于外源基因的插入。
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4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）
催 化 双 链 DNA 一 端 3ˊ-OH 与 另 一 双 链 DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键， 使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接 起来。
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5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）
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二、载体的选择与准备
几种常用克隆载体的比较oli表达
质粒 <10 kb
+ + + +
λ噬菌体 <22 kb
+ + + +
黏性质粒 40～50 kb
+ -
M13噬菌体 <1 kb + + -
注：+表示可用；-表示不可用
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(二)λ噬菌体
噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌 的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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λZiplox载体
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(三)黏性质粒（cosmid）
是由λ噬菌体的黏性末端（cos区）与质 粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其 克隆容量可达40～50 kb。
医学分子生物学
第八章 基因工程与基因体外表达
南华大学生物化学与分子生物学教研室
1
目录 CONTENT
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• 基因克隆的工具酶和载体 • 基因克隆的基本过程 • 真核细胞转染 • 基因的改造 • 克隆基因的表达
• 电子克隆
2
DNA重组是细胞内广泛存在的自然现象
B淋巴细胞受到外来抗原的刺激后，免疫球蛋白基因 发生重组，产生新的抗体，以对抗外来的抗原；
一、限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 从双链DNA内部特异位点识别并且裂
解磷酸二酯键。
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6
1. 限制性核酸内切酶的分类与特点
类型 限制性 修饰作用 识别位点 切割位点
Ⅰ型 有 有 特异 识别位点下游100到1000 bp
Ⅱ型 有 无 特异 可知、固定
TK+: 细胞生长 TK- 细胞导入含TK基因的载体: 细胞在HAT培养基生长
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61
（四）脂质体介导的基因导入
DNA
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（五）显微注射法（microinjection）
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63
二、 转染细胞的筛选
( 一) TK-细胞突变株筛选转染细胞
细胞内TTP的合成有两条途径 从头合成 可被氨基喋呤阻断 补救合成 胸苷激酶(TK)是关键酶
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(四) M13噬菌体 (M13 phage)
一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌 后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型 M13可用作克隆载体。
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37
(五) 病毒载体
逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、 EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒 载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病 毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322的复制子组成。
Ⅲ型 有
有 特异 识别位点附近切割DNA， 切割位点很难预测。
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7
2．限制性内切酶的命名
EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 Ⅰ代表从该菌株中首次分离
到的核酸内切酶
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3．限制性内切酶的识别和切割位点
通常是4～6个碱基对、具有回文序列 （palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位 切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末端（sticky
能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备 载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自 身连接，提高重组效率。
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6. 末端脱氧核苷酸转移酶
（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT )
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第二节 基因克隆的载体
(3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。
(4) DNA序列分析。
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3. 逆转录酶（reverse transcriptase）
一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA 为模板合成DNA， 合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无 3ˊ→5ˊ外切酶活性。
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5 ́ -CTGCA
G-3 ́
3 ́ -G
ACGTC-5 ́
SmaⅠ沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端：
5 ́ -CCCGGG-3 ́ 3 ́ -GGGCCC-5 ́
5 ́ -CCC 3 ́ -GGG