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TaqMan探针结合COLD-PCR原理定量检测JAK2 V617F突变率研究

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梁 国威 ， 冬 华 曹清 芸 王树琴 王新 华 ， 雪松 邵 ， ， ， 徐
（． 天 中心 医院 检 验 科 ， 京 １ ０ ４ ；． １航 北 ０ ０ ９２ 吉林 大学 中 日联谊 医 院 ， 林 长 春 １０ ３ ） 吉 ３ ０ ３
摘要 ： 目的
建 Ｊ ２Ｖ６ ７ ＡＫ １Ｆ突 变 率 的方 法 。方 法
Ｃｌｎ ｃ ｌＬａ ｏ ａ ｏ ｙ， ｒ ｓ ａ ｅＣ ｎ ｅ ｓ ｉａ ， ｉ ｉ ｇ １ ０ ４ ， ｈ ｎ ） ｉ ｉａ ｂ ｒ ｔ ｒ Ａｅ ｏ ｐ ｃ ｅ ｔｒ Ｈｏ ｐ ｔ ｌ Ｂｅｊ ｎ ０ ０ ９ Ｃ ｉ ａ
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中 图 分 类 号 ： ５ ． Ｒ５ １ ３ 文献标识码 ： Ａ
Ｃｏ ｍ ｐｌｆｃ ｔｏ ｔｌｗｅ ｎａ ｕ ａ ｉ ｅ ｐ ｒ ｔ ｒ－ ａ ｉｉａ ｉ ｎ ａ ｏ ｒｄｅ ｔ ｒ ｔｏｎ ｔ ｍ ｅ ａ ｕ ｅ ＰＣＲ ｔ ｑ ａ ｂａ ｅ ｅ ｌｔｍｅ ＰＣＲ ｏ ｑ ｎ ｉａ ｉｅ ｙ ｄ ｔ ｃ ｕｔ ’ ｗｉｈ Ｔａ Ｍ ｎ－ ｓ ｄ ｒ ａ。ｉ ‘ ｔ ｕａ ｔｔ ｔｖ ｌ ｅ ｅ ｔｍ ａ。
ｔ ｒ ｓ ｏ ｄ ｃ ｃ ｅ ｖ ｌ ｅ Ｃｔ ｆ ｒ ｑ ａ ｔｔ ｔ ｅｙ ｄ ｔ ｃ ｔ ｔ ｎ ｒ ｔ ｆＪ ｈ ｅ ｈ ｌ ｙ ｌ ａ ｕ ｓ（ ） ｏ ｕ ｎ ｉａ ｉ ｌ ｅ ｅ ｔｍｕ ａ ｉ ａ ｅ ｏ ＡＫ２ Ｖ６ ７ ｎ ｂ ｏ ｄ ｓ ｍｐ ｅ ｗａ ｓ ａ ｌ ｈ ｄ Ｉ ｖ ｏ １ Ｆ ｉ ｌ ｏ ａ ｌ ｓｅ ｔｂｉ ｅ ．ｎ ｓ
应 用 ＴａＭａ ／ Ｂ探 ｑ ｎ ＭＧ
针 技 术 ， 合 较 低 变 性 温 度 下复 合 扩 增 聚合 酶链 反 应 （ Ｏ Ｄ Ｐ Ｒ） 因 扩 增 原 理 ， 用 Ｒ ａ Ｔｉ Ｃ 结 Ｃ Ｌ －Ｃ 基 采 ｅｌ ｍｅＰ Ｒ分 析 系 统 ， 通 过Ｊ ＡＫ２Ｖ６ ７ １ Ｆ突 变 率 和其 循 环 阈值 （ ｔ ） 标 准 曲线 ， 立 Ｔ ｑ ｎＣ Ｄ Ｐ Ｒ测 定 方 法 ， 对 ９例 骨 髓 增 殖 性 Ｃ值 的 建 ａ Ｍａ－ ＯＬ － Ｃ 并 疾 病 （ Ｄ 患 者外 周 血 基 因 组 Ｄ ＭＰ ） ＮＡ 中 Ｊ ２ Ｖ６ ７ 突 变 率 进 行 检 测 ， 讨 其 应 用 价 值 。 结 果 建 立 的 Ｔ ｑ ｎ ＡＫ １ Ｆ 探 ａ Ｍａ— Ｃ Ｃ ＯＩ＞Ｐ Ｒ方 法 检 测 Ｊ Ｋ２ １ Ｆ突变 率 的检 测 下 限 为 ０ １ ，０ 一 ０ １ 的 Ｊ Ｉ Ａ Ｖ６ ７ ． １０ ． ＡＫ２Ｖ６ ７ 突 变 率 与 其 测 定 的 ｃ １Ｆ ｔ 值 间 呈 明 显 的 线 性 关 系 。对 ９例 ＭＰ 患 者 外 周 血 基 因 组 Ｄ Ｄ ＮＡ 中 Ｊ Ｋ２Ｖ６ ７ Ａ １ Ｆ突 变 率 检 ｉ 显 示 ， 中 ６例 患 者 的 见 ０ 其 Ｊ ＡＫ２Ｖ６ ７ １Ｆ突 变 阳性 ， 变 率 范 围 为 １ ． 一 ５ ． ， 测 序 确 认 全 部符 合 。结 论 突 ８５ ０９ 经 Ｔ ｑ ｎＣ － Ｃ ａ Ｍａ — ＯＩ Ｐ Ｒ方 法 可 高 Ｄ
ｔ ｎ ｒ ｔ ｆ ＡＫ２ Ｖ６ ７ ｎ ｂｏ ｄｓｍｐ ｅ ＬＩ ｉ ａｅｏ ｏ Ｊ １ Ｆ ｉ ｌｏ ａ ｌ ＡＮＧ ｏｗｅ ， Ｇｕ — ｉ ＳＨＡＯ ｎ — ｕ Ｃ Ｄｏ ｇ ｈ ａ， Ａ０ ｎ ｕ ｅ ａ ． Ｄｅ ａ ｔ ｎ Ｊ Ｑｉｇ ｙ ｎ，ｔ １ （ ｐ ｒｍｅ ｔ ｏ
ｂｏｏ ａ ｐｌ． ｅ ｈｏ ｓ Ｃｏｍ ｂ ｎ ｎ ａ ｐｌ ｉ ａ ｉ ｔ Ｌｏ ｅ ｎ ｔ ａ ｉｎ ｍ ｐｅ ａ ｕ ｅＰＣＲ （ ｌ ｄ ｓ ｍ ｅ Ｍ ｔ ｄ ｉ ｉ ｇ Ｃｏ ｍ ｉ ｃ ｔｏｎ ａ ｗ ｒ Ｄｅ ａ ｕｒ ｔｏ Ｔｅ ｆ ｒｔ ｒ ＣＯＩＩ ＰＣＲ ） ｗ ｉｈ Ｔ ａ ＞ ｔ ｑ Ｍ ａ ｎ ｙ ｎｇ ｍ ｅｔ ｏｄ ｉ ｅ ｌｔｍｅ ｆ ｍ ａ ， ｈ ａ Ｍ ａ － ｎ ｇｅ ｏｔ ｐｉ ｈ ｎ ａ ｒ ａ ｉ ｏｒ ｔ ｔ ｅ Ｔ ｑ ｎ ＣＯＩＤ－ ＰＣＲ ｅ ｈ ｄ ｂｙ ｓ ａ ａ ｄ ｃｕ ｖｅｏｆｍ ｕｔ ｉ ａ ｅ ａ ｄ ｍ ｔ ｏ ｔ ｎｄ ｒ ｒ ａｔｏｎ ｒ ｔ ｎ
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Ｃｈ ｎ Ｊ Ｌａ ａ ｎ， ａ ｃ ＂０ ２， ｌｌ Ｎｏ ｉ ｂ Ｄｉ ｇ Ｍ ｒ ｈ， １ Ｖｏ ６， ．３ ２
文 章 编 号 ： ０ ７ ４ ８ （ ０ ２ ０ ～ ０ ９ —０ １ ０ — ２７ ２ １ ）３ ３ ８ ４
Ｔａ Ｍａ ｑ ｎ探 针 结 合 Ｃ Ｄ— Ｃ 原 理定 量 检 测 ＯＬ Ｐ Ｒ Ｊ 变 率研 究 ＡＫ２Ｖ６ １ Ｆ突 ７
灵 敏 度 、 量 检 测 外 周 血 中 Ｊ Ｋ２Ｖ６ ７ 定 Ａ １ Ｆ突 变 率 。该 方 法 将 明 显 提 高 ＭＰ Ｄ疾 病 的诊 断 灵 敏 度 ， 有 助 于 疾 病 治 疗 过 并
程 中治 疗 效果 的 监 测 。
关 键 词 ：ＡＫ ； ｌ Ｆ 较 低 变 性 温 度 下 复 合 扩 增 聚 合 酶 链 反 应 ； 髓 增 殖 性 疾 病 Ｊ ２ Ｖ６ ７ ； 骨

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[转载]Taqman定量PCR

[转载]Taqman定量PCR

[转载]Taqman定量PCR自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则•先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

•所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

•扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

•保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

taqman探针荧光定量pcr原理

taqman探针荧光定量pcr原理

taqman探针荧光定量pcr原理
TaqMan探针荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高保真度、高灵敏度、高特异性的荧光定量PCR技术。

该技术采用的是一种荧光探针——TaqMan探针进行荧光定量。

TaqMan探针是由FAM（荧光染料）标记的探针序列和由Quencher（猝灭剂）标记的引物序列连接而成。

PCR反应过程中，引物与模板DNA特异性结合、延伸。

当引物到达TaqMan 探针的靶位点时，Taq聚合酶酶解TaqMan探针中FAM染料与Quencher猝灭剂之间的化学键，使FAM染料释放并荧光发出，同时探针被降解。

荧光信号的強度与模板DNA浓度成正比关系。

因此，通过TaqMan探针荧光定量PCR技术能够快速、准确地检测和定量基因、病原微生物、突变等一系列生物标记物分子的含量和质量。

Taqman-MGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的JAK2V617F突变

Taqman-MGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的JAK2V617F突变


３ ２岁 ， ３例 ， ３例 。诊断标准符合 ２ ０ 年 ＷＨＯ标准 。 男 女 ０１
１２ １ 样 本 收 集 和 单 个 核 细胞 分 离 患 者 外 周 血 或 者 骨 髓 ．．
因测 序 验证 两 种结 果 。结果 ：Ｒ ａ ｔ ｅＰ Ｒ联 合 Ｔ ｑ ｎ ｅ ｉ Ｃ ｌ ｍ ａｍａ—
分 别 为 ７ ． ％ （ ３ ３ ） ２ ． ％ （ ／ ７ 、２ ５ （ ／ ０ ，经 ６ ７ ２／ ０ 、５ ９ ７ ２ ） ４ ． ％ ９ ２ ）
１２ ２ Ａ ２ ６ ７ ．． Ｊ Ｋ Ｖ １ Ｆ突变检测 提取单 个核 细胞 Ｄ Ａ， 存 Ｎ 保 于一０ ； ２ 利用紫 外分 光 光度计 检测 Ｄ Ａ浓度 ；利用 Ｒ ａ Ｎ ｅｌ ｔ ｅＰ Ｒ联 合 Ｔ ｑ ａ — Ｂ探针检 测样本 Ｊ Ｋ Ｖ １ Ｆ突变 ： ｉ Ｃ ｍ ａｍ ｎＭＧ Ａ ２ ６７
２ｒｉ ５ ％、０ｍ ｎ ５Ｃ， ０Ｓ ５ ， ４ｓ ２ ５ ｎ ０ １ ｉ ￣ ３ ９ ％ ３ ℃， ０个循环。利 ａ ９ ６ 用 Ａ ｐｉ ｉ ｙｔ ｍ软件 观察结果 。限制性片段长度多态性 ｐ ｌｄＢｏ ｓ ｒ ｅ ｓ ｅ
检 测 Ｊ Ｋ Ｖ １ Ｆ突 变 ： 用 引 物 Ｆ ５－ Ｇ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ａ ２ ６７ 利 ： Ｇ Ｇ Ｉ Ｃ Ｔ Ａ Ａ Ｃ
经肝素抗凝后收集 ， 外周血经上臂静脉、 骨髓经髂前上棘或髂
后上棘采集 。利用人 淋 巴细胞 分离 液分离 外周血／ 骨髓单 个
核细胞 。
ＭＧ 探 针 检 测 ８ 例 Ｐ Ｂ ４ ｈ（一）Ｃ Ｄ 患 者 ，４ 例 存 在 ＭＰ ２
Ｊ Ｋ Ｖ １Ｆ Ａ ２ ６７ ，突变率为 ５ ％ ； 中 Ｐ Ｅ Ｉ ０ 其 Ｖ、Ｔ、 ＭＦ患者的突变率
TaqMan探针技术原理

TaqMan探针技术原理

TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。

探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。

当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。

随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。

所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。

信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

图4 TaqMan探针的荧光信号产生机制TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan 探针和TaqMan MGB探针。

MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。

同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针的Tm值提高10°C左右。

因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。

因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。

实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。

图5 TaqMan MGB探针。