实时荧光定量 原理 taqman 探针简介

taqman荧光探针的原理TaqMan荧光探针是一种常用于实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）的探针。

其原理基于PCR扩增过程中的特定核酸序列的扩增和荧光信号的检测。

TaqMan荧光探针由三个部分组成：1. 引物（primers）：引物是设计用于扩增待测核酸序列的短小DNA 片段，通常有两个引物，一个用于扩增待测序列的起始位点，另一个用于扩增终止位点。

2. 探针（probe）：探针是一个含有荧光染料和一个对荧光染料发出信号具有抑制作用的化学修饰的短小DNA片段。

探针的序列与待测核酸序列的中间部分完全匹配。

3. Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）：Taq DNA聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶，能够在PCR反应中扩增DNA序列。

TaqMan荧光探针的工作原理如下：1. 引物与Taq DNA聚合酶一起作用，将待测核酸序列进行扩增。

引物会识别并结合到待测序列的起始位点和终止位点，Taq DNA聚合酶会沿着待测序列进行DNA合成，生成大量的扩增产物。

2. 在PCR反应中，TaqMan探针与待测序列中间部分的完全匹配，探针的5'端和3'端分别连接着两种不同的荧光染料（通常是荧光发射染料和荧光供体染料）。

3. 在PCR反应过程中，当Taq DNA聚合酶在扩增过程中到达探针的位置时，它会剪切探针，将发射染料和供体染料分离，导致荧光信号的释放。

4. 荧光信号可以通过实时荧光PCR仪器进行实时检测和记录。

荧光信号的强度与PCR反应中扩增产物的数量成正比，从而可以定量测量待测核酸的起始量。

TaqMan荧光探针的原理可实现高度特异性和灵敏度的实时定量PCR 分析，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。

希望以上解释对您有所帮助。

如有任何进一步的问题，请随时提问。

taqman探针工作原理
TaqMan探针是一种常用于实时荧光定量PCR的探针。

它的工作原理基于PCR过程中的DNA合成和降解。

TaqMan探针由两个部分组成：一个荧光染料（通常是荧光标记的探针）和一个质子酶（也称为引物）。

这两个部分之间有一个特殊设计的序列，被称为探针的引物序列。

在PCR反应中，当温度升高到合适的退火温度时，Taq DNA 聚合酶会开始合成新的DNA链。

同时，TaqMan探针的引物会与待测DNA序列上的目标区域特异性结合，并被Taq DNA 聚合酶所识别。

在DNA合成过程中，Taq DNA聚合酶会解读引物的序列，并在其5'端的3'端延伸时释放出荧光染料。

当荧光染料释放后，它的荧光信号将被检测仪器记录下来。

此时，PCR反应会不断进行，荧光信号会随着PCR循环的增加而累积。

通过监测荧光信号的强度和周期数，我们可以确定样品中待测DNA的起始量。

由于TaqMan探针的设计是特异性的，只有当引物与目标DNA序列完全匹配时，才会发生荧光信号的释放。

这使得TaqMan探针在实时PCR中具有高度的特异性和准确性。

总之，TaqMan探针通过监测PCR反应中荧光信号的释放来实现DNA定量，是一种可靠、灵敏且广泛应用于分子生物学研究的技术。

taqman探针原理TaqMan探针原理。

TaqMan探针是一种用于实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）的探针，它以其高度特异性和灵敏度而闻名。

在实时PCR中，TaqMan探针可以用来检测和定量特定DNA序列的存在，因此在分子生物学和遗传学研究中得到了广泛的应用。

TaqMan探针的原理基于PCR技术，PCR是一种能够扩增特定DNA片段的方法。

在PCR过程中，DNA片段会被不断复制，从而使得起始数量极少的DNA片段得以扩增至足够数量，以便进行后续的分析。

而TaqMan探针则在PCR的基础上，增加了一种荧光信号检测的方法，使得扩增过程可以实时监测和定量。

TaqMan探针由三部分组成，引物（primers）、探针（probe）和荧光染料。

引物是用于引导PCR反应的两个短的DNA片段，它们会结合到目标DNA序列的两端，并作为PCR反应的起始点。

探针是一段含有荧光标记和荧光信号猝灭子（quencher）的DNA片段，它设计为与目标DNA序列的中间部分互补。

在探针未被降解之前，荧光信号被猝灭子吸收，因此不会被探测到。

当PCR反应进行到一定程度时，引物会引导DNA聚合酶复制探针所在的DNA序列，当DNA聚合酶到达探针时，会降解探针，使得荧光信号被释放出来。

荧光信号的强度与PCR反应中目标DNA的数量成正比，因此可以用来实时监测PCR反应的进程。

TaqMan探针的设计需要考虑到多个因素，包括探针的长度、引物和探针的互补性、探针的荧光标记和猝灭子的选择等。

合理的探针设计可以提高PCR反应的特异性和灵敏度，因此在实际应用中需要进行严格的设计和验证。

总的来说，TaqMan探针原理是基于PCR技术的实时荧光定量PCR方法。

通过引物和探针的设计，以及荧光信号的监测，TaqMan探针可以实现对特定DNA序列的快速、特异性和定量检测。

在分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域，TaqMan探针都发挥着重要的作用，为科学研究和医学应用提供了强大的工具。

TaqMan探针技术原理TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。

由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。

探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。

当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。

随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图4）。

所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。

信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

图4 TaqMan探针的荧光信号产生机制TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的TaqMan 探针和TaqMan MGB探针。

MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。

同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团（图5），可以将探针的Tm值提高10°C左右。

因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。

因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。

实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。

图5 TaqMan MGB探针。

taqman探针原理
Taqman探针是一种基于荧光的实时聚合酶链反应（real-time PCR）技术中常用的探针。

它通过结合于扩增DNA序列的内部区域并在聚合酶链反应过程中进行降解来测量DNA扩增的数量。

Taqman探针主要由一个与目标DNA序列互补的引物和一个含有荧光染料和淬灭染料的荧光探针构成。

在PCR反应开始时，聚合酶链反应体系中存在的引物和Taq DNA聚合酶开始扩增DNA的目标序列。

同时，Taqman探针也与目标序列的内部互补区域结合。

这个内部区域一般位于引物之间，并且特异性地结合于目标序列上。

在DNA扩增的过程中，Taq DNA聚合酶逐渐移动，并且在目标序列的内部区域进行脱氧核苷酸的合成。

这导致Taqman探针在聚合酶链反应的过程中被切割，并将荧光染料和淬灭染料分离开来。

在扩增过程中，荧光染料被释放出来，并且可以被特定荧光探针识别和检测。

一旦有荧光信号的释放，荧光探针就会与其结合，产生荧光信号的峰值。

这使得实时PCR仪器可以测量DNA扩增的数量，从而确定初始样本中目标DNA的量。

Taqman探针的优势在于其高特异性和灵敏度。

由于荧光探针是特异性地与目标序列结合，可以避免假阳性信号的产生。

此外，实时PCR技术可以在PCR反应过程中进行数据收集，使得结果可以实时监测和分析。

总而言之，Taqman探针是一种基于荧光的实时PCR技术中常
用的探针，通过结合于目标序列的内部区域并在PCR反应过
程中降解来测量DNA扩增的数量。

它具有高特异性和灵敏度，并且可以实时监测和分析扩增过程。

taqman荧光定量pcr基本原理
TaqMan荧光定量PCR是指采用荧光标记的PCR技术，它可以实现对特定序列DNA的定量分析，即可以直接测量所检测序列在模板文库中的相对浓度。

TaqMan荧光定量PCR可以说是一种双通道的实时PCR技术，最初由PE Applied Biosystems（PE）推出。

它是通过特定的标记技术，开发了FRET和TaqMan技术，结合PCR技术，以达到定量分析和监测某一特定序列DNA的目的，这种技术比以往的技术有很大的优势，更易于完成。

TaqMan荧光定量PCR的基本原理比较简单，大致可以分为以下四步：
（1）样本处理：检测序列DNA及其作为模板的原始样品将在定量PCR试剂盒中经过一系列处理，得到模板文库。

（2）探针标记：样品处理完成后，将开发出一对对应该特殊序列的5'荧光探针—特殊碱基对相对应的序列和3'分子耦合（MolecularBeacon）。

探针内部具有双螺旋结构，当处于开放状态时，荧光物质才能折射发射自己特有的颜色荧光。

（3）反应物添加：在模板文库中添加进Taq DNA 聚合酶、核酸类型的合成引物，以及缓冲液，用水调节总体浓度。

（4）加热-冷却：完成上述步骤，将反应液放入定量PCR仪，按照一定的条件，经由一系列的加热、冷却过程，Taq DNA聚合酶将碱基对引物合成，产生复制模板文库。

同时在复制过程中，反应液中复制数量也不断增加，一旦达到一定温度，则表明文库复制到足够多，荧光探针能够在反应液中爆炸，产生光谱，得以直接测定检测序列DNA的定量。

此外，TaqMan荧光定量PCR技术能够检测DNA的扩增曲线，并由此提供准确的定量结果，同时也不受PCR技术的一些影响，更易于操作。

taqman探针原理
Taqman探针是一种用于实时聚合酶链反应（real-time PCR）
的荧光标记探针。

它利用荧光共振能量转移（FRET）原理，
对靶标DNA进行定量分析。

Taqman探针包括一个发光染料（如荧光素）连在5'端，一个
荧光抑制剂（如四乙酰基二甲基氧基哌啶，BHQ1）连在3'端。

在无靶标DNA时，发光染料和荧光抑制剂保持在近距离，从
而导致荧光信号被抑制。

当探针与靶标DNA结合时，PCR扩
增过程中，3'至5'外切的Taq聚合酶会识别并切割探针。

此时，荧光染料和抑制剂分离，荧光信号显现出来。

通过实时PCR仪器的荧光探测系统，可以监测到Taqman探
针的荧光信号的增加，以推断靶标DNA的浓度。

通过测量PCR循环数与荧光信号的关系，可以获得准确的定量PCR结果。

Taqman探针的这种特点使得其在基因表达分析、突变检测、
病原体检测等领域具有广泛的应用价值。

它准确、灵敏、特异性高，成为实时PCR中最常用的探针之一。

实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman 探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。

荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。

目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。

广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。

当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。

随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。

也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

(请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。

常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。

当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。

荧光定量PCR一、原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

优点：重复性好，特异性高，灵敏性高，可多重PCR；缺点：只适合特定目标，价格较贵，本底信号较高。

2）SYBR荧光染料：SYBR荧光染料是一种可以结合在DNA双螺旋小沟区域具有绿色激发波长的燃料。

在PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

优点：引物设计方便，价格优势；缺点：特异性差，引物要求高，灵敏度差，不能进行多重定量。

二、内标在传统定量中的意义1．几种传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。

上游引物用荧光标记，下游引物不标记。

在模板扩增的同时，内标也被扩增。

在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。

在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。

荧光定量PCR一、原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。

原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

优点：重复性好，特异性高，灵敏性高，可多重PCR；缺点：只适合特定目标，价格较贵，本底信号较高。

2）SYBR荧光染料：SYBR荧光染料是一种可以结合在DNA双螺旋小沟区域具有绿色激发波长的燃料。

在PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

优点：引物设计方便，价格优势；缺点：特异性差，引物要求高，灵敏度差，不能进行多重定量。

二、内标在传统定量中的意义1．几种传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。

上游引物用荧光标记，下游引物不标记。

在模板扩增的同时，内标也被扩增。

在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。

在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。