TaqMan探针合成

taqman荧光探针的原理TaqMan荧光探针是一种常用于实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）的探针。

其原理基于PCR扩增过程中的特定核酸序列的扩增和荧光信号的检测。

TaqMan荧光探针由三个部分组成：1. 引物（primers）：引物是设计用于扩增待测核酸序列的短小DNA 片段，通常有两个引物，一个用于扩增待测序列的起始位点，另一个用于扩增终止位点。

2. 探针（probe）：探针是一个含有荧光染料和一个对荧光染料发出信号具有抑制作用的化学修饰的短小DNA片段。

探针的序列与待测核酸序列的中间部分完全匹配。

3. Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）：Taq DNA聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶，能够在PCR反应中扩增DNA序列。

TaqMan荧光探针的工作原理如下：1. 引物与Taq DNA聚合酶一起作用，将待测核酸序列进行扩增。

引物会识别并结合到待测序列的起始位点和终止位点，Taq DNA聚合酶会沿着待测序列进行DNA合成，生成大量的扩增产物。

2. 在PCR反应中，TaqMan探针与待测序列中间部分的完全匹配，探针的5'端和3'端分别连接着两种不同的荧光染料（通常是荧光发射染料和荧光供体染料）。

3. 在PCR反应过程中，当Taq DNA聚合酶在扩增过程中到达探针的位置时，它会剪切探针，将发射染料和供体染料分离，导致荧光信号的释放。

4. 荧光信号可以通过实时荧光PCR仪器进行实时检测和记录。

荧光信号的强度与PCR反应中扩增产物的数量成正比，从而可以定量测量待测核酸的起始量。

TaqMan荧光探针的原理可实现高度特异性和灵敏度的实时定量PCR 分析，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变分析等领域。

希望以上解释对您有所帮助。

如有任何进一步的问题，请随时提问。

自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则* 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

* 所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

* 扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

* 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

taqman探针工作原理
TaqMan探针是一种常用于实时荧光定量PCR的探针。

它的工作原理基于PCR过程中的DNA合成和降解。

TaqMan探针由两个部分组成：一个荧光染料（通常是荧光标记的探针）和一个质子酶（也称为引物）。

这两个部分之间有一个特殊设计的序列，被称为探针的引物序列。

在PCR反应中，当温度升高到合适的退火温度时，Taq DNA 聚合酶会开始合成新的DNA链。

同时，TaqMan探针的引物会与待测DNA序列上的目标区域特异性结合，并被Taq DNA 聚合酶所识别。

在DNA合成过程中，Taq DNA聚合酶会解读引物的序列，并在其5'端的3'端延伸时释放出荧光染料。

当荧光染料释放后，它的荧光信号将被检测仪器记录下来。

此时，PCR反应会不断进行，荧光信号会随着PCR循环的增加而累积。

通过监测荧光信号的强度和周期数，我们可以确定样品中待测DNA的起始量。

由于TaqMan探针的设计是特异性的，只有当引物与目标DNA序列完全匹配时，才会发生荧光信号的释放。

这使得TaqMan探针在实时PCR中具有高度的特异性和准确性。

总之，TaqMan探针通过监测PCR反应中荧光信号的释放来实现DNA定量，是一种可靠、灵敏且广泛应用于分子生物学研究的技术。

定量PCR Taqman探针设计要领-2第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。

第四、五、六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。

其中需要注意的是：* 扩增酶最好选用热启动酶* 引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM—900nM之间优化，一般为200nM（注意探针需要避光保存。

* 同样Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U（50ul）* DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

如果欲进行2 Ste p RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，第一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。

第七步：在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。

方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是3.32。

最佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。

所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。

使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。

大多数定量PCR仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

taqman探针原理
Taqman探针是一种基于荧光的实时聚合酶链反应（real-time PCR）技术中常用的探针。

它通过结合于扩增DNA序列的内部区域并在聚合酶链反应过程中进行降解来测量DNA扩增的数量。

Taqman探针主要由一个与目标DNA序列互补的引物和一个含有荧光染料和淬灭染料的荧光探针构成。

在PCR反应开始时，聚合酶链反应体系中存在的引物和Taq DNA聚合酶开始扩增DNA的目标序列。

同时，Taqman探针也与目标序列的内部互补区域结合。

这个内部区域一般位于引物之间，并且特异性地结合于目标序列上。

在DNA扩增的过程中，Taq DNA聚合酶逐渐移动，并且在目标序列的内部区域进行脱氧核苷酸的合成。

这导致Taqman探针在聚合酶链反应的过程中被切割，并将荧光染料和淬灭染料分离开来。

在扩增过程中，荧光染料被释放出来，并且可以被特定荧光探针识别和检测。

一旦有荧光信号的释放，荧光探针就会与其结合，产生荧光信号的峰值。

这使得实时PCR仪器可以测量DNA扩增的数量，从而确定初始样本中目标DNA的量。

Taqman探针的优势在于其高特异性和灵敏度。

由于荧光探针是特异性地与目标序列结合，可以避免假阳性信号的产生。

此外，实时PCR技术可以在PCR反应过程中进行数据收集，使得结果可以实时监测和分析。

总而言之，Taqman探针是一种基于荧光的实时PCR技术中常
用的探针，通过结合于目标序列的内部区域并在PCR反应过
程中降解来测量DNA扩增的数量。

它具有高特异性和灵敏度，并且可以实时监测和分析扩增过程。

荧光引物合成一、荧光引物的定义和作用荧光引物是一种能够与DNA或RNA结合并发出荧光信号的化学物质，广泛应用于分子生物学领域中的核酸检测、定量和序列分析等方面。

荧光引物在PCR扩增、实时荧光定量PCR和DNA测序等技术中都有重要应用。

二、荧光引物的种类1. TaqMan探针：由一个特殊设计的寡核苷酸序列和两个荧光染料（FAM和TAMRA）组成，其中一个染料作为信号发射器，另一个染料则作为内部参照。

2. 分子探针：由两个分子组成，一个是靠近3'端的荧光基团（如FAM），另一个是靠近5'端的淬灭基团（如DABCYL）。

3. Beacon探针：由一段互补于目标序列片段的寡核苷酸序列和两个相互作用的染料组成，其中一个染料被称为“簇辅基”，另一个则被称为“信号发射器”。

三、荧光引物合成步骤1. 设计引物：根据目标序列的特点，设计出适合的引物序列。

2. 合成荧光染料：根据需要选择合适的荧光染料，并按照化学方法进行合成。

3. 修饰引物：将荧光染料与引物结合，通常采用互补配对、磷酸二酯化学或者硫代化学方法进行修饰。

4. 纯化和质检：对合成的荧光引物进行纯化和质检，确保其纯度和质量符合要求。

四、荧光引物合成中的注意事项1. 引物设计时应考虑到目标序列的GC含量、长度、互补性和特异性等因素。

2. 荧光染料的选择应考虑到其发射波长、强度、耐久性和稳定性等因素。

3. 引物修饰时应掌握好反应条件，避免过度修饰或不足修饰。

4. 合成后的荧光引物需要经过纯化和质检等步骤，确保其质量符合要求。

五、总结荧光引物是分子生物学领域中重要的工具之一，在核酸检测、定量和序列分析等方面发挥着重要作用。

荧光引物的种类较多，包括TaqMan探针、分子探针和Beacon探针等。

荧光引物的合成过程需要注意引物设计、荧光染料选择、引物修饰和质检等方面的问题，以确保合成的荧光引物质量符合要求。

taqman荧光探针的原理(一)taqman荧光探针原理解析简介•荧光探针是一种用于检测和定量分析核酸的常用实验工具。

•taqman荧光探针是一种特殊类型的荧光探针，常用于PCR（聚合酶链式反应）实验中。

PCR简介•PCR是一种重要的生物技术方法，用于扩增特定DNA片段，从而进行基因分析。

•PCR利用DNA polymerase酶将DNA模板连续地复制扩增为大量的DNA。

taqman荧光探针基本构成•taqman荧光探针由三个部分组成：报告基团、Q基团和修饰基团。

•报告基团和修饰基团之间有一个Q基团。

taqman荧光探针原理•PCR反应过程中，当DNA合成酶到达taqman荧光探针时，会将其附近的DNA链分解。

•在DNA链分解的过程中，酶释放出探针中的Q基团。

•释放的Q基团会使得探针的报告基团和修饰基团之间的距离缩短，从而产生荧光信号。

•PCR反应继续进行，PCR仪器会记录荧光信号的强度。

taqman荧光探针在PCR实验中的应用•taqman荧光探针可用于定量PCR实验，用于定量目标基因的表达水平。

•通过测量荧光信号的强度，可以确定PCR反应中的DNA扩增量。

•这种定量方法比传统的凝胶电泳方法更准确、灵敏。

taqman荧光探针的优势•taqman荧光探针有高度的特异性和敏感性，能够精确检测靶标DNA片段。

•与其他一些常用的荧光探针相比，taqman荧光探针的实验操作相对简单，结果可靠。

taqman荧光探针的应用领域•taqman荧光探针广泛应用于基因表达研究、病原体检测、遗传疾病筛查等领域。

•在医学诊断中，taqman荧光探针也被用于检测与疾病相关的基因突变。

结论•taqman荧光探针作为一种高效的核酸检测工具，已被广泛应用于生物科学领域。

•其原理简单而可靠，为科研人员提供了一种准确、敏感的DNA定量分析方法。

taqman荧光探针的设计原则•taqman荧光探针的设计需要考虑以下几个原则：1.荧光探针长度一般为20至30个核苷酸，应确保与目标序列特异性结合。

Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报收稿日期：2022-03-11基金项目：国家重点研发计划（2022YFD1800504）作者简介：孙彤，女，兽医学硕士，主要从事动物疫病检测通信作者：陈鸿军，E-mail：***************.cn 2024,32(1):122-128·研究论文·尼帕病毒TaqMan 探针荧光定量PCR 检测方法建立摘 要：尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病，为能够快速特异检测该病毒，本研究根据尼帕病毒（NiV ）N 基因序列保守区设计特异性引物和探针，建立一种针对NiV 的TaqMan 探针荧光定量PCR （qPCR ）检测方法，该方法特异性好、敏感性高、稳定性强，可鉴别NiV 与其他猪病病毒，扩增效率为102%，最低检测限14.8 copies/μL ，敏感性高于常规PCR 10倍，该检测方法的建立可为NiV 的快速检测提供技术手段，对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。

关键词：尼帕病毒；N 基因；TaqMan 探针；实时荧光定量PCR 中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）01-0122-07Development of a TaqMan Probe Fluorescence Quantitative PCR Method forDetection of Nipah VirusSUN Tong, SUN Zhuyun, LIU Jingyi, WANG Peipei, SU Chang, CHEN Hongjun(Evaluation Center for Veterinary Drug, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)孙 彤，孙竹筠，刘静宜，王培培，苏 苌，陈鸿军（中国农业科学院上海兽医研究所 兽药评价中心，上海 200241）Abstract: Nipah virus (NiV) infection is a severe infectious disease and also a zoonotic illness. In order to detect the virus quickly and specifi cally, specifi c primers and probe were designed in this study based on the conserved region of the NiV N gene . Subsequently, a TaqMan probe fluorescence quantitative PCR ( q PCR) method was developed for detection of NiV. This qPCR method had good specificity without reaction with other swine viruses and high sensitivity with 10 times sensitive than conventional PCR and strong stability. In addition, its amplifi cation effi ciency reached to 102% and the minimum detection limit was 14.8 copies/μL. Availability of this qPCR method provided a technical means for the rapid detection of NiV and was of great signifi cance to pig industry. Key words: Nipah virus; N gene; TaqMan probe; quantitative PCR尼帕病毒（Nipah virus, NiV）为副粘病毒科，亨尼病毒属，具有宿主范围广、致死率高的特点，尼帕病毒病（Nipah virus disease, NVD）为人畜共患的自然疫源性疾病，于1998年首次在马来西亚被发现，随后在新加坡、马来西亚、印度等国家暴发[1]，给养猪业造成巨大经济损失，为公共卫生带来巨大威胁。