Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术

实时荧光定量PCR的原理及实验不管是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，仍是研究药物对基因表达水平的阻碍，或监控药物和疗法的医治成效，定量pcr技术都能够发挥专门大作用。

定量pcr技术的最新进展是实时荧光定量。

该技术借助于荧光信号来检测pcr产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还能够做到pcr每循环一次就搜集一个数据，成立实时扩增曲线，准确地确信ct值，从而依照ct值确信起始dna拷贝数，做到了真正意义上的dna定量。

这是dna定量技术的一次飞跃。

依照最终取得的数据不同，定量pcr能够分为相对定量和绝对定量两种。

典型的相对定量如比较通过不同方式处置的两个样本中基因表达水平的高低转变，取得的结果是百分比；绝对定量那么需要利用标准曲线确信样本中基因的拷贝数或浓度。

依照所利用的技术不同，荧光定量pcr又能够分为taqman探针和sybr green i荧光染料两种方式。

比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精准；荧光染料技术那么本钱更为低廉，实验设计更为简便。

在选择实验方案时要依如实验目的和对数据精度的要求来决定。

定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以排除偶然误差。

因此重复实验和设立内对照超级重要。

由于各类各样的客观缘故，这一点在实践中往往被轻视或轻忽，需要着重强调。

固然，与定性实验一样，定量pcr也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能显现的问题。

1什么缘故终点定量不准确？咱们都明白理论上pcr是一个指数增加的进程，可是实际的pcr扩增曲线并非是标准的指数曲线，而是s形曲线。

这是因为随着pcr循环的增多，扩增规模迅速增大，taq酶、dntp、引物，乃至dna模板等各类pcr要素慢慢不敷需求，pcr的效率愈来愈低，产物增加的速度就慢慢减缓。

当所有的taq酶都被饱和以后，pcr就进入了平台期。

由于各类环境因素的复杂彼此作用，不同的pcr 反映体系进入平台期的机会和平台期的高低都有专门大转变，难以精准操纵。

荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。

二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。

选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。

至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。

荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。

激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。

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荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。

2011-05-17 08:41
什么是TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料？荧光定量PCR中TaqMan荧光探针的原理及SYBR荧光染料的作用。

TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。

SYBR荧光染料：在传统PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，这样就保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

当PCR循环复制时DNA双链也成倍增长，同样SYBR 染料的荧光的信号也随之增倍，通过实时监测整个PCR进程中荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。

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临床分子生物学检验智慧树知到期末考试答案章节题库2024年湖南师范大学1.人类基因计划的大部分测序工作是利用YAC实现的。

（）答案:错2.线粒体病主要累及大脑和肌肉组织。

（）答案:对3.HER2可作为早期诊断乳腺癌的参考依据。

（）答案:对4.荧光原位杂交可同时检测多种靶序列。

（）答案:对5.TPMT与嘧啶类药物的疗效和毒副作用密切相关。

（）答案:错6.Northerm 杂交检测靶序列是RNA。

（）答案:对7.高通量表面增强激光解吸电离飞行时间质谱可获得“癌症指纹”信息。

（）答案:对8.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症呈X染色体连锁不完全隐性遗传。

（）答案:错9.PCR是已知突变检测的“金标准”。

（）答案:错10.结核杆菌分子生物学检测包括特异性基因检测和耐药基因检测。

（）答案:对11.电喷雾质谱技术是一种软电离技术。

（）答案:对12.核糖体蛋白是基于MALDI-TOF-MS进行细菌鉴定的主要标志物。

（）答案:对13.实时荧光定量PCR引物的最适长度为15～30nt。

（）答案:错14.肺癌的诊断主要依靠分子生物学检验。

（）答案:错15.逆转录病毒的基因组是单倍体。

（）答案:错16.染色体的形态最典型和清晰的阶段是有丝分裂间期。

（）答案:错17.PCR 技术的本质是核酸重组技术。

（）答案:错18.双脱氧链终止法测序需要加入双脱氧核苷酸。

（）答案:对19.Tm 主要与 A-T 含量有关。

（）答案:错20.产前诊断的金标准是对羊水或脐带血细胞进行染色体核型分析。

（）答案:对21.16SrRNA基因作为细菌分类鉴定的靶基因的优点有（）答案:多信息###长度适中###多拷贝22.关于沙眼衣原体的分子生物学检验，正确的是（）答案:RAPD技术不适用于血清学分型###PCR扩增靶基因序列主要有外膜蛋白基因、隐蔽性质粒DNA和16S rRNA基因序列###PCR-RFLP可用于CT分型###LCR技术适合于高危人群普查时大批量标本的检测23.SELDI-TOF-MS中蛋白质芯片系统的组成主要包括（）答案:芯片###芯片阅读器###分析软件24.CYP450基因分型检测的分子生物学方法有（）答案:实时荧光定量PCR###等位基因特异性PCR###基因芯片###PCR-RFLP25.临床分子生物学实验室检测方法的选择原则包括（）答案:根据本地区患者的承受能力选择###根据实验室的技术特点选择###根据检测目的选择###根据实验室的实验条件选择26.PML-RARa融合基因常用的检测方法有（）答案:RT-PCR###荧光原位杂交###荧光定量PCR27.原癌基因激活的机制包括（）答案:易位激活###癌基因甲基化程度降低###原癌基因扩增###点突变28.法医物证学的主要内容有（）答案:种族和种属认定###性别鉴定###个体识别###亲子鉴定29.关于DHPLC技术的描述正确的是（）答案:灵敏度和特异性高###自动化程度高###是分析异质性突变的首选方法###可实现高通量检测30.理想的质控品应满足以下要求（）答案:稳定、价廉、同一批次可大量获得###无已知的生物传染危害性###基质与待测样本一致###阳性质控品所含待测物浓度接近试验的决定性水平###靶值或预期结果已知31.乙型肝炎病毒的核酸类型是（）答案:双股DNA32.TPMT是下列哪类药物在体内代谢的关键酶（）答案:嘌呤类33.采集用于PCR检测的血清样本时，不宜选择使用的抗凝剂是（）答案:肝素34.奥美拉唑在体内代谢主要受哪种药物代谢酶的影响？（）答案:CYP2C1935.PCR的退火温度通常比引物的Tm值（）答案:低约5℃36.HLAI类抗原的特异性取决于（）答案:α重链37.可以用来分辨16SrRNA基因不能鉴别的非常接近的菌种和种内菌株的是（）答案:16S-23S rRNA基因38.单细胞基因扩增一般采用下列哪项技术增加检测的敏感性和特异性（）答案:巢式PCR39.Southern 印迹杂交中常用的核酸变性剂是（）答案:氢氧化钠40.DNA指纹的分子遗传学基础是（）答案:DNA的多态性41.新一代测序技术最显著的特点是（）答案:高通量42.微卫星异常的检测方法有（）答案:DNA测序43.PCR的引物Tm值的计算公式为（）答案:Tm= 2(A+T)+4(G+C)44.PCR循环中的延伸时间取决于（）答案:扩增产物的长度45.线粒体基因组22个tRNA可转录几种tRNA （）答案:20种46.保证结果准确可靠的先决条件是（）答案:分析前质量控制47.肿瘤的分子诊断策略有（）答案:检测肿瘤相关基因48.在PGD中诊断单基因疾病的主要手段是（）答案:单细胞PCR技术49.焦磷酸测序法突出的优势是（）答案:较长的读长50.寡核苷酸探针的最大优势是（）答案:可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列51.非整倍体筛选的诊断方法主要借助于下列哪项技术（）答案:FISH52.乙型肝炎病毒可分为多少个基因型？（）答案:853.TaqMan 探针技术要求扩增片段应为（）答案:50～150bp54.目前对肺癌遗传易感性主要集中在如下哪几个领域（）答案:DNA修复能力55.临床分子生物学检验的核心技术是（）答案:核酸扩增技术56.临床分子生物学检验标准化的前提是（）答案:标准品57.临床基因扩增检验实验室设计的原则主要包括（）答案:分区设置###控制空气流向58.质量管理体系文件具有法规性、唯一性和时效性三大特性。

荧光探针和荧光染料来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-10-18实时荧光PCR 定量包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是不利用杂交原理，而利用其他的一些理化特征指示扩增产物的增加。

前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。

1．TaqMan 探针TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端， 而淬灭剂则在3’末端。

当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。

在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断， 使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。

一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。

随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。

因此Taqman 探针检测的是积累荧光。

常用的荧光基团是FAM ，TET ，VIC ，HEX 。

2．分子信标（molecular beacon）分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。

荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。

分子信标的茎环结构中，环一般为15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。

荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。

在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。

与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。

当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。

由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。

常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。

3．SYBR Green ISYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。

荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。

二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。

选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。

至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。

荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。

激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。

染料法和探针法荧光定量PCR（RT-qPCR）的优缺点比较一、荧光染料法(SYBR Green)其原理是：在PCR反应体系中加入过量荧光染料，DNA扩增的过程中，荧光染料特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强，并且可以实时测量。

如果你要扩增你的目标样品40个循环，在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。

优点：1、成本较低，适合大规模的实验。

2、在实验设计阶段非常省时，因为它只需要合适的引物设计。

缺点：1、特异性不是很高。

染料可以插入任何双链DNA，包括引物二聚物和非特异性产物。

2、如果引物二聚体存在或者产物受到污染，得到的结果会不可靠。

3、更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。

需要更多的时间进行结果分析。

二、寡核苷酸探针(Taqman)这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短DNA分子)，探针通常在5 端和3 端都被标记。

在探针的5’端有报告基团，3’端设计淬灭基团，当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。

RT-qPCR反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与PCR产物同步。

使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游互补序列的结合。

优点：1、更有可能只放大所需的产物，由于引物和探针的结合具有特异性。

2、不需要解离曲线，只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。

3、由于具有特异性，数据更可靠。

4、数据分析时节省时间。

缺点：1、需要大规模实验时耗费成本高。

2、需要更长的时间来设计实验，因为需要好的引物和探针。

总的来说，这两种荧光检测方法都很有效，但对于你的具体实验，可以选择适合的方法。

三类证的荧光定量PCR一、引言荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR）技术是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的实时监测，对PCR产物进行定量分析的方法。

由于其具有高灵敏度、高特异性和可定量等优点，荧光定量PCR技术在生物学、医学和生物技术等领域得到了广泛应用。

本文将重点介绍三类证的荧光定量PCR技术及其应用。

二、三类证的荧光定量PCR技术1.荧光染料与探针荧光定量PCR中常用的荧光染料包括SYBR Green和TaqMan探针。

SYBR Green是一种可以与DNA结合的染料，随着DNA的扩增，荧光信号逐渐增强。

TaqMan探针则是通过与目标DNA的特异性结合，在DNA聚合酶的催化下释放荧光信号。

这两种方法各有优缺点，应根据实验需求选择合适的荧光染料或探针。

2.荧光定量PCR仪器荧光定量PCR仪是进行荧光定量PCR实验的关键设备，其性能直接影响实验结果的准确性和可靠性。

荧光定量PCR仪应具备实时监测荧光信号、自动进行PCR扩增和数据分析等功能。

此外，仪器的精密度、重复性和稳定性也是选择仪器时应考虑的重要因素。

3.引物设计引物设计的合理性直接影响到PCR反应的特异性、效率和产物量。

设计引物时应选择特异性高的位点，避免引物二聚体和发夹结构的形成，同时要确保引物在目标DNA上的结合效率和扩增效率。

对于复杂的基因组，可以采用特异性更高的多重引物设计。

三、三类证的荧光定量PCR的应用1.基因表达分析利用荧光定量PCR技术可以对基因表达进行准确分析。

通过对不同条件下基因的表达水平进行比较，可以研究基因的表达调控机制，为疾病诊断、药物研发和生物科学研究提供有力支持。

例如，研究肿瘤细胞中癌基因的表达水平可以帮助理解肿瘤的发生和发展机制；检测病原体基因的表达水平有助于了解疾病的传播和病程进展。

2.突变检测与基因分型荧光定量PCR可以对DNA序列的突变进行检测和定量分析，常用于遗传性疾病、癌症和病原体的突变检测。

SYBR与TaqManSYBR? Chemistry or other double-stranded DNA binding dyes背景与双链DNA结合的小分子可分为两类:, 嵌入剂, 小沟结合物无论哪种结合方法，用于实时PCR检测的DNA结合染料均有两个要求:, 当与双链DNA结合时，荧光强度增加, 无PCR抑制性我们已经开发出了在PCR中使用SYBR? Green I染料的条件，它几乎无PCR抑制性，且检测的灵敏度高于溴化乙锭。

Additionally, we have newer SYBR? Green dyes that fluoresce more brightly and inhibit PCR less thanthe original SYBR? Green I.How SYBR? Dye Chemistry WorksSYBR? dye detects polymerase chain reaction (PCR) products by binding to double-stranded DNA formedduring PCR. 其作用原理如下:逐步过程1. When SYBR? dye is added to a sample, it immediately binds to all double-stranded DNA present in thesample.2. 在PCR过程中，DNA聚合酶扩增靶序列，形成PCR产物。

3. SYBR? dye then binds to each new copy of double-stranded DNA.4. 随着PCR反应的进行，会形成更多PCR产物。

SYBR? dye binds to all double-stranded DNA, so theresult is an increase in fluorescence intensity proportioned to the amount of PCR product produced.Advantages of SYBR? Dye, It can be used to monitor the amplification of any double-stranded DNA sequence., 无需探针，节省了分析设置和运行成本 (如果您的PCR引物设计良好且反应极佳)。

实时荧光定量PCR原理及应用一、原理：1.荧光探针原理：a. TaqMan探针：TaqMan探针是由小分子荧光染料和一个捕获目标序列的DNA探针构成。

在PCR过程中，TaqMan探针会结合到特定的目标序列上，当DNA聚合酶在PCR反应中扩增特定序列时，探针被加性外切酶活性所降解，导致荧光信号逐渐降低，通过荧光信号的减弱来量化目标DNA的数量。

b. SYBR Green探针：SYBR Green探针是一种可以与双链DNA特异性结合的染料，当SYBR Green与PCR产物结合时，荧光信号增加。

通过测量荧光信号的增加来量化目标DNA的数量。

c. Molecular Beacons：Molecular Beacons是由在末端带有荧光分子和淬灭荧光的猝灭体构成的。

在PCR过程中，当Molecular Beacons与目标序列匹配时，荧光信号释放，通过测量荧光信号的释放来量化目标DNA的数量。

2.PCR反应原理：a.变性：将含有目标DNA序列的模板DNA样品与引物和荧光探针混合，加热至高温，使DNA双链解除成两股单链DNA。

b.引物结合：将反应体温度降低，引物结合到目标DNA序列的特定区域，并与模板DNA进行互补组装。

c.扩增：在DNA聚合酶的作用下，引物在模板上逐渐沿着DNA链延伸，产生新的DNA片段。

每一轮PCR循环结束后，荧光信号会相应地增加。

二、应用：1.目标基因表达分析：可以用实时荧光定量PCR测定特定目标基因的表达水平，从而研究基因的功能、调控机制或者生理功能的变化。

2.病原体检测：实时荧光定量PCR可以检测和定量各种病原体，例如病毒、细菌、真菌等。

常见的应用包括检测呼吸道病原体、性传播疾病病原体、食物中污染的细菌等。

3.肿瘤检测：实时荧光定量PCR可以用于肿瘤相关标志物的检测，帮助早期筛查和诊断肿瘤。

4.遗传突变检测：可以通过实时荧光定量PCR检测人类基因中的突变位点，提供遗传病检测和个体基因组分析的支持。

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR）的方法学建立QRT-PCR原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

检测方法包括SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法，在基础研究中，应用比较广泛的为SYBR GreenⅠ法，因此，以下主要针对SYBR GreenⅠ法的方法学建立。

一、RNA的提取及质量检测Trizol法提取RNA的原理：Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

1、用液氮将组织研碎，按照50-100 mg组织加入1mL的Trizol® Reagent（若样品为细胞，则按照5-10x106个细胞加入1mL的Trizol® Reagent来裂解细胞），室温裂解5 min，使核蛋白复合物充分分离。

2、每1 mL的Trizol® Reagent加入200 μl氯仿，剧烈摇晃、混匀，室温静置5 min。

于4℃离心机12000 g离心15 min，离心后，混合物分为下层（红色酚氯仿）中层和上层（无色的水相层，约占总体积的50%），RNA存留于上层水相中。

用移液器吸出样品中的水相转移至另一EP管中，勿吸出中间相和有机相。

3、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl异丙醇，轻轻混匀，室温孵育10 min。

于4℃离心机12000 g离心10 min，RNA沉于管底，弃上清。

4、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl 75%的乙醇洗涤RNA，于4℃离心机7500 g 离心10 min，用75%乙醇洗涤RNA两次。

5、去除管中75% 乙醇，将RNA自然晾干5 min。

罗氏荧光定量 PCR 是一种高灵敏度、高精确度的多重荧光定量 PCR 技术，可以用于定量检测 DNA 或 RNA 中的特定序列。

该技术不仅可以用于基础研究，还可以应用于临床诊断和药物研发等领域。

一、基本原理罗氏荧光定量 PCR 基于 PCR 扩增技术，在 PCR 反应过程中，使用荧光标记的探针来定量检测扩增产物的数量。

该技术采用两个荧光染料：SYBR Green 和 TaqMan 探针。

SYBR Green 是一种结合双链 DNA 的荧光染料，可以在 PCR 反应过程中不断累积，并发出荧光信号；而 TaqMan 探针是一种在 PCR 反应过程中被水解释放的荧光探针，可以在特异性结合目标序列后发出荧光信号。

通过测量这些荧光信号的强度，可以确定 PCR 反应产物的数量。

二、实验步骤1. 样品制备首先需要从样品中提取出目标 DNA 或 RNA，常用的提取方法包括酚-氯仿提取法、磁珠法等。

提取后需要进行纯化和定量，确保样品质量和浓度符合要求。

2. PCR 反应将样品DNA 或RNA 与特异性引物、荧光探针和PCR Master Mix 混合，加入 PCR 反应管中，进行 PCR 扩增反应。

PCR 扩增条件需根据具体引物和模板 DNA/RNA 来确定，一般包括以下步骤：(1) 热变性：将反应体系加热至 95℃，使 DNA/RNA 双链分离为单链。

(2) 退火：将反应体系降温至引物的退火温度，使引物与模板DNA/RNA 特异性结合。

(3) 延伸：利用DNA/RNA 聚合酶将引物延伸，合成新的DNA 单链。

(4) 荧光检测：在延伸过程中，荧光探针与目标序列特异性结合，发出荧光信号。

荧光信号的强度与产物数量成正比，可以通过检测荧光信号来定量 PCR 扩增产物。

3. 数据分析利用荧光数据分析软件对荧光信号进行分析，得出 PCR 扩增产物的数量。

根据标准曲线，可以将荧光信号转化为目标序列的数量，从而定量检测样品中的目标 DNA 或 RNA。

qpcr原理qPCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测DNA或RNA的数量。

其原理基于传统PCR技术，通过连续复制目标DNA或RNA片段来扩增其数量，但qPCR还引入了荧光探针，并结合实时荧光测量技术，使得扩增反应可以在扩增过程中实时监测。

在qPCR中，反应体系包括需要检测的DNA或RNA样本、引物（primers）、荧光探针（通常为TaqMan探针或SYBR Green I染料）和DNA聚合酶。

首先，反应体系中的引物与目标序列的特定区域进行互补配对，DNA聚合酶通过复制酶活性在引物的补充下合成新的DNA链。

随着扩增反应的进行，目标序列的数量逐渐增加。

而对于TaqMan探针法，荧光探针包含一个特异性引物和一个含有荧光染料和荧光淬灭剂的探针。

当引物在反应体系中与目标序列结合时，探针也与目标序列结合，这使得荧光染料与淬灭剂距离足够近，从而导致荧光信号失活。

但在聚合酶复制过程中，探针的内切部位被酶降解释放出，荧光染料与淬灭剂分离，从而荧光信号得以恢复。

检测仪器会实时测量这种信号变化，而荧光信号的强度与起始目标序列的数量成正比。

而SYBR Green I染料法，则是直接使用SYBR Green I染料结合到扩增的DNA链上，由于SYBR Green I染料在结合DNA时荧光信号升高，可以通过测量荧光信号变化来定量目标序列的数目。

通过检测荧光信号的实时变化，可以确定扩增反应的指数增长期（exponential growth phase），并确定荧光计量周期。

通过与已知浓度的标准曲线进行对比，可以计算出样本中目标序列的初始浓度。

与传统PCR相比，qPCR具有高灵敏度、高准确性和高特异性的优势。

它广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传标记定位等领域，并成为许多实验室中常用的技术。

pcr荧光探针的种类一、TaqMan探针TaqMan探针是PCR荧光探针中最为常见和经典的一种。

它由一段特异性引物序列和荧光素（如荧光染料FAM或HEX）以及一个与之相对应的荧光淬灭剂（如BHQ1）组成。

在PCR过程中，TaqMan探针与目标序列结合，聚合酶在引物的作用下进行扩增，同时荧光淬灭剂与荧光素之间的作用导致荧光信号的熄灭。

当目标序列存在时，聚合酶链式反应会产生足够的引物与目标序列结合，使荧光信号得以释放，从而实现目标序列的检测和定量。

二、Molecular Beacon探针Molecular Beacon探针是一种具有发光信号的二级结构DNA探针。

它由一段特异性引物序列、两个互补序列和两个荧光素（如FAM和Cy5）组成。

Molecular Beacon探针在非结合状态下形成一个环状结构，荧光素与其互补序列相互靠近，使荧光信号熄灭。

当目标序列存在时，引物与目标序列结合，使Molecular Beacon探针发生结构改变，从而使荧光素与互补序列分离，荧光信号得以释放。

Molecular Beacon探针具有较高的特异性和灵敏度，被广泛应用于基因表达分析和突变检测等领域。

三、Scorpion探针Scorpion探针是一种结构特殊的PCR荧光探针。

它由特异性引物序列、荧光素（如FAM）和荧光淬灭剂（如BHQ1）组成。

Scorpion探针在非结合状态下形成一个环状结构，荧光淬灭剂与荧光素之间的作用导致荧光信号熄灭。

当目标序列存在时，引物与目标序列结合，使Scorpion探针发生结构改变，从而使荧光淬灭剂与荧光素分离，荧光信号得以释放。

Scorpion探针具有较高的特异性和灵敏度，广泛应用于基因表达和突变分析等领域。

四、SYBR Green探针SYBR Green探针是一种与DNA结合并发出荧光信号的染料。

它能与所有PCR扩增产物结合，因此不需要设计特异性引物。

在PCR 过程中，SYBR Green与扩增产物结合，发出荧光信号。

第三节结果１．ＴａｑＭａｎ探针ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ方法及ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｒｅａｌ．ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ方法测定定量曲线各个稀释度ＲＳ标准品在第一个循环结束后测到一个基础吸光值，图１－ａ中一直到第１５个循环结束时都没有明显变化，从第１５个循环开始ｌＸ１０７ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬＲＳ标准品的吸光值增大，定量曲线开始抬头，１８个循环（Ｃｔ值）后，曲线迅速上扬，至第２８个循环前后达到峰值，随后进入平台期，一直到反应结束，此后的标准品的Ｃｔ值依次延迟约３个循环，但除１０个拷贝Ｒｓ标准品外，各扩增曲线的斜率相同，间距相等，相互平行，阴性对照ＰＣＲ级水的扩增曲线稍有起伏。

而图ｌ－ｂ中从第１１个循环开始ｌＸ１０７ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬＲＳ标准品的吸光值增大，１５个循环后，曲线迅速上扬，至第３０个循环前后达到峰值，随后同样进入平台期，至反应结束，１０２和１０个拷贝ＲＳ标准品几乎同时在３３个循环左右出现曲线，但斜率不同，阴性对照ＰＣＲ级水也出现了扩增曲线，但吸光值不高（见图１）。

图１－ａＴａｑＭａｎ探针ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ测得１０倍系列稀释ＲＮＡ标准品的荧光定量曲线。

由左至右分别是１×１０７ｃｏｐｉｅｓ／Ｉ＿ｔＬ、ｌ×１０６ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬ、１×ｌ０５ｃｏｐｉｅｓ／／ａＬ、ｌ×１０４ｅｏｐｉｅｓ／Ｉ．ｔＬ、１×１０３ｃｏｐｉｅｓ／Ｉ．ｔＬ、ｌ×１０２ｃｏｐｉｅｓ／ｐＬ、１×１０１ｃｏｐｉｅｓ／ＢＬ，最下面一条线是ＰＣＲ级水做的阴性对照。

横坐标显示的是循环数，纵坐标是荧光值。

Ｆｉｇ．１－ａＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈ１０一ｆｏｌｄｓｅｒｉａｌｄｉｌｕｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＲＮＡｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＲＳ）ｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅ．Ｆｒｏｍｌｅｆｔｔｏｒｉｇｈｔａｒｅｓｔａｎｄａｒｄｓｆｒｏｍｌ×１０７ｃｏｐｉｅｓ／ｌＪＬｔｏ１×１０１ｃｏｐｉｅｓ／ｌｘＬ．Ａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒ０１．ｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅＲＮＡｗａｓｒｅｐｌａｃｅｄｗｉｔｈＰＣＲ－ｇｒａｄｅｗａｔｅｒ．Ｔｈｅｘ－ａｘｉｓｓｈｏｗｓｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＰＣＲｃｙｃｌｅｓａｎｄｔｈｅｙ－ａｘｉｓｓｈｏｗｓｔｈｅｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ．ｂ图１．ｂＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｒｅａｌ—ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ测得１０倍系列稀释ＲＮＡ标准品的荧光定量曲线。

恒温荧光pcr的原理恒温荧光PCR是一种用于检测和放大DNA序列的技术，它结合了PCR放大技术和实时荧光检测技术。

其原理主要包括PCR反应、荧光探针检测和实时检测三个方面。

首先是PCR反应。

PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种体外复制DNA 的技术，通过热循环反应来扩增DNA序列。

在恒温荧光PCR中，PCR反应基本步骤包括变性、退火和延伸。

变性阶段将双链DNA分离成两条单链，退火阶段让引物结合到目标序列的两端，延伸阶段则由热稳定的DNA聚合酶在较高温度下合成新的DNA链。

其次是荧光探针检测。

恒温荧光PCR借助于特殊的荧光探针来实时监测PCR反应过程中DNA的扩增情况。

通常使用的探针包括SYBR Green和T aqMan探针。

SYBR Green是一种DNA染料，当与双链DNA结合时会发出荧光信号，可以通过检测荧光信号的增加来监测PCR反应的进行。

TaqMan探针则是一种双荧光探针，其内含有荧光素和淬灭剂，当Taq聚合酶在延伸过程中遇到探针时，会将其切割并释放荧光素，通过检测荧光素的释放来实时监测PCR反应的进行。

最后是实时检测。

恒温荧光PCR技术可以实时监测PCR反应产物的累积情况，通过检测荧光信号的强度来确定反应的进行和终止时刻。

实时检测技术可以提供反应动力学信息，如扩增曲线、阈值周期数等，从而定量反映样本中目标DNA的含量和质量。

这使得恒温荧光PCR在诊断、疾病筛查、基因表达分析和病原体检测等领域具有重要的应用价值。

总的来说，恒温荧光PCR技术结合了PCR反应和实时荧光检测技术，通过荧光探针实时监测PCR反应过程中DNA序列的扩增情况，从而可以快速、准确地检测和定量目标DNA序列。

这一技术在医学、生命科学和生物工程领域具有广泛的应用前景。