载体构建流程

载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。

过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。

Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。

载体构建技术基本流程
载体构建的基本流程：
1.载体质粒的选择；
2.引物设计；
3.PCR扩增；
4.载体和⽬标⽚段的限制性酶切；
5.连接转化；
6.挑取克隆提质粒验证。

重要的是，我们要为⼤家提供了⼀个载体构建流程模板，构建载体时希望⼤家可以创建⼀个word⽂档，按照我们提供的模板，将载体构建过程记录下来，便于后续优化。

后续⽂章中我们将举例告诉⼤家如何使⽤这个模板。

P.S. 构建表达载体时可以先连接T载体，可把步骤（12）酶切⽚段换成连接T载体后再对T载体进⾏酶切。

连接T载体会多花⼀天时间，但是可以使载体构建流程更顺利。

连接T载体与连接⽬的载体⽅法⼗分类似，本次举例不再涉及。

如果想要通过连接T载体过渡，可以⽹上搜索T载体相关产品说明书，了解T载体和连接T载体的⽅法。

引物设计的内容我们将放在接下来的⼀篇推送⾥，正在构建载体的⼤家，先尝试使⽤我们的载体构建流程模板吧。

酶切法构建载体的流程酶切法构建载体的那些事儿。

一、准备工作。

这就好比做饭之前得先把食材和厨具都准备好一样。

构建载体前，得把载体和目的基因这两个关键的东西准备妥当。

载体就像是一辆小货车，它能把我们的目的基因运输到我们想要的地方去。

这个载体要选择合适的，就像选车得根据货物的大小、运输的路况来选一样。

目的基因呢，那可是我们的宝贝货物，要通过各种手段把它提取出来，确保它的纯度和完整性。

另外，还得准备好各种酶，就像厨师做菜需要各种调料一样。

像限制性内切酶，这可是关键的酶，它就像一把小剪刀，能在特定的位置把载体和目的基因剪开。

还有连接酶，它的作用就是把剪开又处理好的载体和目的基因连接起来，就像胶水把东西粘在一起似的。

而且，反应缓冲液也不能少，这就像是酶发挥作用的小环境，没有合适的缓冲液，酶可能就不好好干活啦。

二、酶切过程。

这一步可重要啦。

把载体和目的基因分别放到不同的小管子里，加入适量的限制性内切酶和反应缓冲液。

然后就把这些小管子放到一个小仪器里，让它们在合适的温度下反应。

这个温度就像是酶的舒适区，不同的酶有不同的舒适温度。

在这个过程中，限制性内切酶就开始发挥它的小剪刀功能啦，在载体和目的基因上特定的位置咔嚓咔嚓地剪开。

这就像是给载体和目的基因做了一个小手术，让它们有合适的接口可以连接。

三、处理酶切产物。

酶切完了可不能就直接用。

得把酶切产物处理一下。

因为酶切之后可能会有一些小的片段或者残留的酶，这些东西可能会影响后续的连接反应。

这时候就像是给刚裁剪好的布料再整理整理，把那些多余的线头剪掉。

一般可以通过一些方法把残留的酶去掉，让酶切产物变得干干净净、利利索索的。

四、连接反应。

处理好的载体和目的基因就可以开始连接啦。

把它们放到一个管子里，加入连接酶和反应缓冲液。

然后又把这个小管子放到合适的温度下。

连接酶就开始工作啦，它把载体和目的基因的切口连接起来。

这就像是把裁剪好的布料缝成一件漂亮的衣服。

经过这个过程，一个新的带有目的基因的载体就构建好啦。

载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。

9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。

⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。

2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。

限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。

限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。

其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。

Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。

构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。

常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。

2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。

可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。

3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。

这些序列将调控基因的表达方式和水平。

4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。

5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。

常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。

6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。

7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。

8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。

需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。

在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。