载体构建流程
1．基因的获得
酶切回收
2．回收
A．酶切回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。
B．PCR回收：一般做总体系为100-200ul的PCR量（用高保真酶：如PFU酶、KOD PLUS 酶），分成约50ul/管，然后上PCR仪。跑电泳回收，约30ul。
酶切回收，做100ul体系，直接过回收柱回收DNA片段。
3．连接
连接体系总量一般为10-20ul。12℃-16℃过夜。
4．转化
一般转化DH5α感受态，10-15ul 连接液转化到50ul感受态中。
冰浴1h 热休克42℃ 90 秒
冰浴5分钟加200ul LB液，37℃振摇1 h
铺相应抗性的平板。置37℃孵箱，培养12h.
5．挑克隆
从平板上挑取数个克隆，于相应抗性的LB中，37℃培养12h.
6．抽提质粒
手工抽提质粒，一般溶于30ulTE或EB。
7．鉴定
A．酶切鉴定：一般用什么酶装上的，就用什么酶鉴定。但原则是选用相对便
宜的酶。
选择原来载体上没有而基因上有的酶切位点与载体上另一酶切位
点共同鉴定。
一般鉴定选择2-4组酶，来确定构建的载体是否正确。
B．PCR鉴定：一般扩增目的条带。也可扩增载体和目的条带连接处的片段。
