各种感受态细胞

感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。

一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。

由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。

其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。

这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。

2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。

这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。

一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。

此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。

3、利用小分子引起的感受态细胞制备。

小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。

这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。

以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。

此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。

另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。

因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。

取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。

取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。

感受态细胞制备的⼏种⽅法⼤肠杆菌感受态细胞的⼏种制备⽅法关于感受态细胞(Competent cells)常态的细胞不能摄⼊外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进⼊⼤肠杆菌必须⾸先制备感受态的⼤肠杆菌细胞。

受体细胞经过⼀些特殊⽅法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发⽣变化，成为能容许多有外源DNA的载体分⼦通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化，是将异源DNA分⼦引⼊⼀细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的⼀种⼿段，是基因⼯程等研究领域的基本实验技术。

进⼊细胞的DNA分⼦通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所⽤的受体细胞⼀般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有⼀个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转⼊可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各⾃都没有酶活性，但它们可以融为⼀体形成具有酶活性的蛋⽩质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产⽣的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作⽤于⽣⾊底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)⽽产⽣蓝⾊的菌落，所以利⽤这个特点，在载体的该基因编码序列之间⼈⼯放⼊⼀个多克隆位点，当插⼊⼀个外源DNA⽚段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作⽤，就不能产⽣具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为⽩⾊，⽽没有重组质粒的菌落为蓝⾊。

⼤肠杆菌感受态细胞的⼏种制备⽅法⽅法⼀：细菌转化的⽅法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本⽅法是⽤冰预冷的CaCl2或多种2价阳离⼦等处理细菌，使之进⼊感受态得以转化。

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。

转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）For personal use only in study and research; not for commercial use一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。

感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。

2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。

5。

注意:接种比例不得大于1:１0。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。

4、4℃５000g离心５分钟。

用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。

分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。

含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。

28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。

感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。

感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。

(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。

1感受态细胞：细菌处于0℃，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA 复合物。

钙离子的作用是结合于细胞膜上，是细胞膜呈现一种液晶态。

在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，使外源DNA进入。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。

将快速生长中的大肠杆菌（对数生长期）置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球），使细菌处于容易吸收外源DNA的状态。

感受态细胞):受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。

2分子克隆中重组体筛选和鉴定的原理方法：重组克隆的初步筛选克隆的筛选可以根据载体类型、受体细胞特性的变化、外源DNA分子本身的特性，采用不同的方法。

主要有遗传学检测、物理特性检测、分子杂交以及免疫学分析等。

从初步筛选直到分子杂交，进一步到DNA测序和基于蛋白质功能的分析，使得对克隆的检测逐步深入、精确。

.1 重组克隆的遗传学检测遗传学检测方法是重组子筛选过程中最初的检测步骤。

重组子的表征来源于载体所携带的标记和重组子结构特性。

根据这两类表征对重组子进行初步筛选。

(1) 抗药性筛选这是利用载体DNA上组装的抗药性选择标记进行筛选的方法。

常用的抗生素筛选剂:氨苄青霉素（ampicillin，Ap或Amp）；氯霉素（chloramphenicol，Cm 或Cmp）；卡那霉素（kanamycin，Kn或Kan）；四环素（tetracymic，Tc或Tet）；链霉素（2）插入失活筛选法检测克隆载体携带有外源DNA的通常方法是插入失活。

经过抗药性筛选获得的大量转化子中既包含所需要的重组子，也包含非重组子。

感受态细胞制备原理
感受态细胞（Acceptablecell）又称转基因细胞、外源DNA转化细胞，是指外源基因与宿主基因组结合并在宿主细胞内稳定表达的细胞。

根据其来源的不同，可分为外源基因在大肠杆菌中表达的感受态细胞和质粒在酵母中表达的感受态细胞。

外源DNA进入细胞后，首先与细胞核内的DNA聚合酶结合，使DNA聚合酶分子分解成单链，然后由DNA聚合酶催化单链复制形成双链DNA分子。

在这一过程中，DNA聚合酶活性与病毒颗粒的基因片段大小相关。

当感受态细胞将外源DNA 导入到受体细胞后，它们与受体细胞内的DNA聚合酶和DNA 聚合酶复合体结合，从而使载体上的目的基因片段得以复制和表达。

当质粒上的目的基因被整合到受体细胞基因组中时，目的基因被激活。

当感受态细胞与受体细胞融合后，被激活的目的基因便会在受体细胞中以单拷贝形式表达出来。

因此，感受态细胞对目的基因有较强的选择压力，在表达过程中会筛选出最具表达潜力的部分。

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几种常用的感受态细胞
DH5α
具有α-互补性，便于鉴别重组体菌株。

该菌株可用于制作基因库、进行亚克隆等，由于该菌株同时具有deoR 变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。

Stbl3
常规质粒制备的宿主菌，可进行蓝白斑筛选。

该菌株是复制慢病毒载体系统推荐使用的菌株，对慢病毒载体等较大的质粒转化的效果好，有效减低错误重组的可能性。

Top10
一种用于培养质粒平板和粘粒平板的大肠杆菌菌株，可用于蓝白斑筛选。

该菌株适用于DNA 克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

2T1
具有四环素抗性基因（TetR）；自身的ton A基因型能够阻止噬菌体T1和T5的感染；形成菌落时间较其他菌株快（约12小时），适合构建高质量的基因组文库。

BL21（DE3）
经过特殊改造的专门用来表达T7启动子启动基因的表达用大肠杆菌菌株。

DH5α：DH5α菌株是实验室最常用的感受态细胞。

缺失核酸内切酶 (endA)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型 (recA)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA 的稳定性；lacZΔM15的存在使DH5α可用于蓝、白斑筛选。

DH5α感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>5×108 cfu/μg DNA。

TOP10：TOP10菌株来源于MC1061菌株，是目前实验室最常用的感受态细胞之一，基因型与DH10B高度类似(DH10B为gal E15型，而TOP10为gal U型)。

TOP10生长速度快(比DH5α快，但比Mach1-T1生长速度慢)，10小时可见克隆，rec A1和end A1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。

可用于构建克隆，蓝白斑筛选等实验。

TOP10感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>5×108cfu/μg DNA。

JM109：JM109菌株来源于E.coli K strain，是提取高质量DNA的理想菌株，rec A1和end A1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。

携带hsd R17基因型背景，使得异源DNA不被内源核酸酶系统降解。

laqI q ZΔM15的存在使JM109可用于构建克隆，蓝白斑筛选实验；JM109感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率可达109cfu/μg DNA。

Mach1-T1:Mach1-T1菌株由野生型non-K-12 E. Coli W菌株改造而来，是目前生长速度较快的感受态细胞之一，在平板上8h可见克隆，缺失核酸内切酶(end A)，提高了质粒DNA的产量和质量；重组酶缺陷型(rec A1398)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入DNA的稳定性；lacZΔM15的存在使Mach1-T1可用于蓝、白斑筛选；tonA突变赋予Mach1-T1菌株对噬菌体T1和T5的抗性。