转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞

转化、转导、转染和感染概念的辨析在基因克隆技术中，转化、转导、转染和感染是将外源基因导入受体细胞的四种技术，概念上容易混淆，在此作一详解。

1 转化( transformation)“转化”一词来源于著名的细菌转化实验。

1944年，美国微生物学家艾弗里从杀死的光滑型肺炎球菌( 有荚膜) 中提取DNA，将其与粗糙型肺炎球菌( 无荚膜) 一起培养，结果发现部分粗造型肺炎球菌转变成光滑型。

这项研究轰动了整个生物界，首次确立了DNA是遗传物质的概念。

因此，在微生物学中，转化指细菌吸收外源性DNA 而改变自身遗传性状的现象。

转化现象在原核生物中广泛存在，是自然界外源基因重组的一种主要形式。

在基因工程研究中，最常用的受体菌大肠杆菌，自然条件下很难吸收外源性DNA。

1973年，美国斯坦福大学的科恩等报道，经氯化钙处理的大肠杆菌很容易摄取外源性DNA，由此建立了大肠杆菌转化体系，这对基因工程的建立具有重要意义。

因此，在分子克隆技术中，转化特指将质粒DNA 或以它为载体构建的重组子直接导入细菌细胞的过程。

2 转导( transduction)转导现象的发现者是美国科学家津德和莱德伯格。

他们在研究中发现，P22噬菌体感染宿主细菌细胞时，在形成子代噬菌体颗粒时，噬菌体外壳蛋白偶尔会将细菌染色体片段包裹进去，而不是它们自己的遗传物质。

当这种噬菌体再次感染细菌时，注入细菌细胞的却是原宿主细菌的部分基因。

在遗传学上，转导是指以噬菌体为媒介，将细菌的小片段染色体或基因从一个细菌转移到另一个细菌的过程。

根据这种现象，将噬菌体DNA 改造成基因工程载体( 如λ噬菌体载体) ，用噬菌体外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体，就能以感染的方式进入宿主细菌，使目的基因得以复制繁殖。

噬菌体转导技术的建立，大大提高了外源基因导入受体细胞的效率，广泛应用于DNA 文库构建。

因此，在分子克隆技术中，转导特指以噬菌体DNA 为载体，将外源DNA 导入细菌细胞的过程。

大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。

转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。

进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。

主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。

主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。

处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。

转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。

进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。

主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。

主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL 离心管(9)1.5mL离心管(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3～5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。

第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。

如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。

为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。

DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。

分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。

体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。

感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。

本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。

2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。

进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。

大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。

而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。

感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。

本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。

转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。

或者：设计好实验项目，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作）3.细菌培养液，各加无菌水至150μL（不超过200μL）涂LB/ Amp/IPTG/X-Gal平板（此步骤的目的是计算转化率）；对其余各项，分别各取一半涂布于LB/ Amp平板上，余下的转化液置4℃冰箱保存。

倒置平板，37℃培养12-14小时。

一般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌比无活性酶的细菌生长慢，故过夜培养后可见到毫米大小的阳性白色菌落而阴性的兰色菌落只有针尖大小。

5. 将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时。

6. 计算转化率，统计每个培养皿中的菌落数。

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下： 转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。

但它们的转化效率并不一定一样。

有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。

第四节 注意事项与提示1. 倒平板时应避免培养基温度过高，若温度过高，则加入的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表面及皿盖会形成大量冷凝水，易于造成污染及影响单菌落的形成。

若用手掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55℃左右。

制备好的LB/Amp平板可于4℃冰箱储存2个月，时间过长氨苄青霉素将会失效。

加了IPTG/X-Gal的LB/Amp平板最好现用。

CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞原理：转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。

受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。

准备：1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，高温高压灭菌；注：CaCl2必须为分析纯以上。

5.5492、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净，高温高压灭菌；注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。

3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。

将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。

注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。

实验步骤：1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。

注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。

（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。

接合、转化、转染、转导的区别转化，转导，转染的区别是什么--------------------------------------------------------------------------------转化(transformation)指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。

转染（transfection）采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌，再将重组噬菌体DNA直接导入受体细胞，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染。

转染是转化的一种特殊形式。

转导Transduction 是指通过病毒将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象。

如果供体DNA未与受体DNA发生重组则称此转导过程为流产转导.1、Conjugation 中文翻译为“结合”Conjugation is the mechanism by which genetic material is transferred between two bacterial cells by plasmids. A cell containing a conjugativeplasmid(F+,fertility+)forms a mating pair with a cell that does not contain a conjugative-plasmid(F-)by means of an F-pilus on the surface of the cell.The pilus contracts,pulling the two cells into contact, and the conjugative plasmids(typified by the F plasmid of E.coli ) is transferred from the plasmid-containing cell, the donor, to the recipient(in some cases,pieces of chromosomal DNA is also transfered to the recipient). The tra genes, carried on the F plasmid, contain all the information for the conjugative process.《Instant notes in Microbiology》p125说明：Conjugation 发生在原核生物，这个定义里面的关键是“ The pilus contracts,pulling the two cells into contact”这种细胞间的直接接触。

Affinity：亲和力，抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力。

Agglutination：凝集反应，细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物的过程。

Avidity：亲和力，抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间相适应而存在着的引力，是抗原抗体间固有的结合力。

Blocking：封闭，是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。

Blotting：印迹，就是将电泳分离后的琼脂糖凝胶中核酸片段转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上的过程，转移后核酸片段保持相对位置不变。

Coating：包被，即将抗原或抗体连接到固相载体上的过程。

ELISA：酶联免疫吸附测定是一种抗原（或抗体）固相化后，与待测抗体（或抗原）及酶标记抗体形成复合物，底物被酶催化成有色物质，产物的量与样本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析的免疫测定法。

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay：酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种抗原（或抗体）固相化后，与待测抗体（或抗原）及酶标记抗体形成复合物，底物被酶催化成有色物质，产物的量与样本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析的免疫测定法。

Gene Chip：基因芯片又称DNA 芯片、生物芯片，在一张固相支持介质上同时固定成百上千个核酸片段，再将扩增的核酸样品与之杂交，反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪或CCD摄像技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的总信息，是集成化的核酸分子杂交技术。

HA：血凝素，是由3 条糖基化多肽分子以非共价形式聚合而成的三聚体，其C 末端有一疏水区插入病毒囊膜的双层脂质膜中，是与病毒囊膜的结合部位。

HI：血凝抑制，先将可溶性抗原与特异性抑制血球凝集的血清(抗体) 混合，隔一定时间后加入“致敏红细胞红”(细胞表面吸附可溶性抗原)，则不再与相应抗体发生凝集现象的过程。

DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化DNA重组DNA重组（基因重组）是指，由不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。

原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。

受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。

通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。

自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。

高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。

基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用，也是基因工程中的关键性内容。

基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA 分子连接，得到重组DNA，并将其导入到受体中（微生物或高等动植物），从而使受体获得某些有益性状。

1977年美国科学家首次用重组的人生长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。

此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果。

质粒把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。

YAC、BAC、噬菌体、细菌质粒等是重组DNA技术中常用的载体。

一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。

质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。

CaCl2法制备大肠杆菌感受态转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。

进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。

将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。

一. 材料E. c oli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ;pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf 管。

二. 试剂1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。

2.Amp母液：配方见第一章。

3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。

4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。

5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。

质粒DNA的转化(CaCl2法)CaCl2法的基本原理：细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面，经短时间42℃热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，可获得细菌菌落。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

一、材料pUC19质粒，大肠杆菌感受态，1.5ml塑料离心管，离心管架，1000 ul、200ul枪头，9cm培养皿，一次性滤膜（0.22um），大量碎冰二、设备微量移液器(2μl,200μl,1000μl)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，培养箱，恒温水浴锅，恒温摇床，离心机超净工作台，双蒸水器，冰箱等。

三、试剂准备LB固体培养基LB液体培养基氨苄青霉素（apm）：无菌水配置成100mg/ml溶液，用滤膜抽滤，-20℃保存灭菌双蒸水ddH2O四实验操作（1）平板的制备：LB固体培养基中加入Amp (100μg/ml)，转化反应前一天，倒置平板，保存。

（2）分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作：第一组，质粒DNA组：2 µl pUC19质粒DNA +100µl感受态细胞悬液第二组，空白对照组，2ul无菌水＋100µl感受态细胞悬液（3）将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温90s，然后迅速冰上冷却2min（4）立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总体积到0.5ml，摇匀后于37℃振荡培养约30-60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。

1第六节大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、基本知识核酸不能自己进入细菌,而是需要帮助,并对细菌经过处理,才能穿过细胞的内、外膜进入,在里边表达和复制。

☺感受态细胞:受体细胞经过一些特殊方法的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞(Competent cells 。

☺转化(Transformation :是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

2二、大肠杆菌感受态细胞的制备常用CaCl 2成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA 产生5×106~2×l07个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒上进行的常规克隆的需要。

适用于大多数大肠杆菌菌株,并且快速,重复性更好。

制备的感受态细胞可贮存于-70℃,数月至1年。

但保存时间过长会使转化效率受到影响。

新鲜细胞4 ℃保存可用5天。

用于电转化法的感受态细胞的制备使用低盐缓冲液或水洗细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA 分子导入受体细胞。

(具体操作及参数,参考仪器说明3☺下列有3个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的:–转化缓冲液中试剂的纯度–细胞的生长状态–玻璃和塑料器皿的清洁度4例:Cacl 2法制备感受态细胞(化学法步骤:1从于37℃培养16~20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm ,转到一个含有100ml LB 或SOB 培养基的1L 烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养约3小时。

为得到有效转化,活细胞数不应超过108细胞/ml ,可每隔20~30分钟测量OD 600值来监测培养物的生长情况。

2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml 丙烯管中,在冰上放置10分钟,使培养物冷却至0℃。

3于4 ℃,离心10分钟,以回收细胞。

4倒出培养液,将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。