高中生物 考点加强课6 限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定

基因工程【考点梳理.逐个击破】一、基因工程的操作工具1．限制性核酸内切酶(简称限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

(2)作用：识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

(3)结果：产生黏性末端或平末端。

2．DNA 连接酶3．载体(1)作用：携带外源DNA 片段进入受体细胞。

(2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

(3)条件⎩⎪⎨⎪⎧能自我复制有一个至多个限制酶切割位点有特殊的标记基因二、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的获取(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是具有调控作用的因子。

(2)获取方法⎩⎪⎨⎪⎧从基因文库中获取利用PCR 技术扩增通过化学方法人工合成2．基因表达载体的构建 (1)构建基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。

②使目的基因能够表达和发挥作用。

(2)基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子及标记基因等。

3．目的基因导入受体细胞微生物细胞感受态细胞法(Ca2＋处理法)4．目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法判断标准目的基因是否插入转基因生物的DNA DNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA 分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术是否出现杂交带个体水平的检测如抗虫、抗病的接种实验是否表现出相应的特性三、基因工程的应用及蛋白质工程1．基因工程的应用(1)动物基因工程：提高动物生长速度从而提高产品产量；改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。

(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。

2．基因诊断与基因治疗(1)基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。

限制酶选择的三大依据1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类图1（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ（目的基因两端均具PstⅠ）。

（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。

（2）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。

2.根据质粒的特点确定限制酶的种类（1）所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

（2）质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。

（3）所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点（如图2中KpnⅠ）。

如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

（4）所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中Hin dⅢ会破坏启动子，Eco RⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。

3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。

如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。

若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。

（分析如下）1.（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam HⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

1.限制酶的选择原则（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图甲可选择PstⅠ.②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,以防破坏目的基因,如图甲不能选择SmaⅠ.③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和Eco R Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）,而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子.（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保具有相同的黏性末端.②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,应至少含有一个完好的标记基因,如图乙中限制酶pstⅠ因其会破坏标记基因而不宜选择.③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点,如果所选酶的切点不止一个,则切割重组后可能会丢失某些片段,若丢失的片段含复制原点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制.④所选限制酶,其切点应位于启动子与终止子之间,如图乙中Hin dⅢ会破坏启动子,Eco RⅠ会破坏终止子,而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间.（3）参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶若质粒上标出T－DNA片段,则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中,从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上,如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA,获得含目的基因的片段.若利用该片段构建基因表达载体,则下图中甲、乙、丁,Ti质粒均不宜选择,而丙Ti质粒宜选取.（分析如下）2.目的基因的检测与鉴定（1）界定“标记基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用:①载体上标记基因的标记原理载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因.目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力.当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞,倘若在选择培养基中不能存活,则表明无质粒转入,当然不会有“目的基因”转入,能存活时必含该载体,原理如下图所示:②“标记基因”筛选后为何还需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因是否转入?经上述步骤筛选得到的受体细胞,只是含特定的标记基因的质粒,然而,该质粒上是否成功嵌入了目的基因,还不能确定,故仍需使用“目的基因”作探针,利用DNA 分子杂交技术,检测受体细胞的质粒上是否含目的基因.（2）使用“目的基因”作探针,运用“分子杂交技术”检测目的基因是否转录出特定mRNA.（3）采用“抗原—抗体杂交技术”,从转基因生物中提取蛋白质（作抗原）与相应抗体杂交,依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成. （4）采用抗虫、抗病毒等“接种实验”进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的检测.【例证】（2016·全国卷Ⅲ,40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam HⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）.根据基因工程的有关知识,回答下列问题:（1）经Bam HⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接,理由是_________________________________________________________________________________________________________________________ （2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子,如图（c）所示,这三种重组DNA分子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有,不能表达的原因是_____________________________________________________________________________________________图（c）（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有和,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________________. [慧眼识图获取信息]（1）三种限制酶切割结果分析（2）表达载体与重组DNA分子分析答案（1）Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录（3）E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶1.（2018·南京、盐城、连云港二模）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主,接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法.下图为“转基因酵母乙肝疫苗”的生产过程示意图,该过程所用酵母菌为毕赤酵母菌,其体内无天然质粒,科学家改造出了下图所示的pPIC9K质粒（松弛控制型,复制不受宿主细胞控制）用作载体,其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组,将目的基因整合于染色体中以实现表达.请回答下列问题:（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组,应该在HBsAg基因两侧的A 和B位置接上限制酶的识别序列,这样设计的优点是可避免质粒和目的基因的自身环化.步骤1应选用（选填“E·coli”或“T4”）DNA连接酶.（2）步骤2的目的是.已知大肠杆菌每20 min分裂一次,若1个大肠杆菌中导入了10个重组质粒,则1 h后可从1个大肠杆菌的后代中得到重组质粒的个数.（3）步骤4中应选用限制酶切割重组质粒以获得一段线性DNA,然后将其导入毕赤酵母菌细胞.为了确认毕赤酵母菌转化是否成功,应在培养基中加入以便筛选.除此以外,还可以用分子杂交技术鉴定上图中的毕赤酵母菌转化是否成功,过程如下图所示:根据图中显示结果推算,若要获得16个成功导入该基因的酵母菌菌落,则上图A 中的酵母菌菌落数至少要为个.（4）已知质粒在细胞传代过程中有丢失现象,试分析毕赤酵母表达系统的遗传稳定性高于大杆菌表达系统的主要原因是________________________________. 解析（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组,HBsAg基因插入的位置应该在pPIC9K质粒的启动子和终止子之间,pPIC9K质粒的启动子和终止子之间有限制酶Sna B Ⅰ和A v rⅡ的识别位点,所以在HBsAg基因两侧的A和B位置要接上限制酶Sna B Ⅰ和A v rⅡ的识别序列,可避免质粒和目的基因的自身环化.限制酶Sna B Ⅰ切割后是平末端,限制酶A v rⅡ切割后是黏性末端,而T4DNA连接酶既可连接平末端又可连接黏性末端,所以步骤1应选用T4DNA连接酶.（2）步骤2是将重组质粒导入大肠杆菌体内进行扩增,以获得大量重组质粒.pPIC9K质粒是松弛控制型,复制不受宿主细胞控制,所以无法确定1个大肠杆菌复制3次后得到重组质粒的个数.（3）由步骤4中获得的一段线性DNA两侧序列可知,应选用限制酶BglⅡ切割重组质粒,该线性DNA中含卡拉霉素抗性基因,应在培养基中加入卡拉霉素以便筛选转化成功的毕赤酵母菌.由图可知,图A中的酵母菌菌落数为15个时,用分子杂交技术鉴定有2个转化成功,所以要获得16个成功导入该基因的酵母菌菌落,图A中的酵母菌菌落数至少要为16÷2×15＝120个.（4）毕赤酵母表达系统中目的基因整合到酵母染色体上,不易丢失,而大肠杆菌表达系统中质粒在细胞传代过程中有丢失现象,所以毕赤酵母表达系统的遗传稳定性更高.答案（1）Sna B Ⅰ和A v rⅡT4（2）获得大量重组质粒（扩增）不确定（3）BglⅡ卡拉霉素120（4）目的基因整合到酵母染色体上,不易丢失2.（2018·淮中、南师附中、海门、天一四校联考）基因表达载体的构建是基因工程的核心.图1为限制酶Eco RⅠ的识别序列,图2表示目的基因及限制酶切点,图3表示目的基因上的DNA片段,图4表示质粒.回答下列问题:（1）若用图1所示的限制酶Eco RⅠ切割外源DNA,就其特异性而言,切开的是之间相连的化学键.（2）图3为目的基因中的某一片段,下列有关叙述正确的是（多选）.A.若图中的ACT能决定一个氨基酸,则ACT可称为一个密码子B.DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于②处,解旋酶作用于①处C.若只用这个片段中的3个碱基对,排列出的DNA片段有64种D.就游离的磷酸基而言,该片段与重组质粒相比多了2个游离的磷酸基（3）若利用PCR技术增加目的基因的数量,由图2可知,A、B、C、D 4种单链DNA片段中应选取作为引物（DNA复制子链的延伸方向5′→3′）.该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生等长的目的基因片段个. （4）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选,提高重组效率,应该选择的限制酶是.如果用限制酶PstⅠ、Eco RⅠ和Hin dⅢ同时对质粒进行切割,假设同时只有任意两个位点被切断且每次机会相等,则形成含有完整抗四环素基因的DNA片段有种.（5）如果大肠杆菌是受体细胞,则其体内应不含基因,以利于筛选出含重组质粒的受体菌.目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质,其遗传学基础是_____________________________________________________.解析（1）限制酶Eco RⅠ识别序列为GAATTC,切割位点在G与A之间,切开的是鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸之间相连的磷酸二酯键.（2）决定氨基酸的密码子在mRNA上,A错误；DNA聚合酶和DNA连接酶都可作用于②磷酸二酯键处,解旋酶作用于①氢键处,B正确；假设只用这个片段中的3个碱基对,排列出的DNA片段一定小于64种,C错误；该片段含2个游离的磷酸基团,重组质粒是环状DNA,不含游离的磷酸基团,D正确.（3）由于DNA复制时子链的延伸方向为5′→3′,所以选C和B作为引物.该DNA分子在PCR仪中经过3次循环后会产生2个等长的目的基因片段,经过n次循环后产生等长的目的基因片段为2n—2n个,4次循环后会产生等长的目的基因片段8个.（4）为了使目的基因和质粒定向连接应该选择双酶切,质粒上至少要有一个标记基因存在,所以用限制酶PstⅠ、Eco RⅠ.用限制酶PstⅠ、Eco RⅠ和Hin dⅢ同时对质粒进行切割,若顺时针方向PstⅠ与Eco RⅠ之间的片段为a,Eco RⅠ与Hin dⅢ之间的片段为b,Hin dⅢ与PstⅠ之间的片段为c,则只有任意两个位点被切断且每次机会相等时,形成的片段有a、b＋c、b、a＋c、c、a＋b,其中含有完整抗四环素基因的DNA片段只有b ＋c这1种.（5）经以上分析,重组质粒构建时,抗青霉素基因被破坏,只保留了抗四环素基因,所以为了筛选出含重组质粒的受体菌,受体细胞中应不含标记基因抗四环素基因.由于所有生物共用一套遗传密码子,所以目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质.答案（1）鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸（2）BD（3）B和C8（4）PstⅠ、Eco R Ⅰ1（5）抗四环素各种生物共用一套遗传密码子课后·加强训练（时间:20分钟）1.（2016·全国卷Ⅰ,40）某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Amp r或Tet r中会导致相应的基因失活（Amp r表示氨苄青霉素抗性基因,Tet r表示四环素抗性基因）.有人将此质粒载体用Bam HⅠ酶切后,与用Bam HⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌,结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化.被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌.回答下列问题:（1）质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有__ _____________ （答出两点即可）,而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子.（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是___________________________________________________________________；并且和的细胞也是不能区分的,其原因是____________________________________________________________________. 在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落,还需使用含有的固体培养基.（3）基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自于_________________________________________________________.解析（1）作为运载体必须具备如下特点:①能自主复制,从而在受体细胞中稳定保存；②含标记基因,以供重组DNA的鉴定和筛选；③具一个至多个限制酶切割位点以便外源DNA插入.（2）在含有氨苄青霉素的培养基上,只有具有Amp r的大肠杆菌才能够生长.而Amp r位于质粒上,故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Amp r,不能在培养基中生长,而仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Amp r因而能在培养基中生长.目的基因的插入破坏了质粒载体的Tet r,故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长,从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌得以区分.（3）噬菌体是病毒,无细胞结构,无法自主合成DNA,需借助宿主细胞完成DNA 复制.答案（1）能自我复制、具有标记基因（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）二者均含有氨芐青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长四环素（3）受体细胞2.（2018·盐城三模）薄荷可产生蚜虫报警信息素EβF,用于驱散蚜虫并吸引蚜虫的天敌.通过基因工程可制备含EβF合成酶基因的转基因抗蚜麦.请回答问题: （1）薄荷利用EβF驱散蚜虫并吸引蚜虫的天敌,体现了生态系统的信息传递具有, 维持生态系统稳定性的功能.（2）若利用PCR技术获取EβF合成酶基因,在PCR反应体系中需加入、模板序列、原料及两种.如果提取到薄荷细胞中EβF合成酶的mRNA,则可用法获取目的基因.（3）研究者利用4种限制酶切割目的基因和质粒,各限制酶的识别序列和切割位点如下图所示.酶切后的产物连接时,目的基因上SalⅠ切割产生的末端应与质粒上切割产生的末端相连接.连接完成后,该连接点（选填“能”或“不能”）被这两种限制酶中的某一种切割.（4）欲从个体水平上检测转基因抗蚜麦是否培育成功,在小麦叶片上接种蚜虫后,通过观察叶片上蚜虫的或作为判定的依据.（5）下列属于转基因抗蚜麦推广种植后引发的安全性问题的是（多选）.A.小麦不再感染蚜虫B.目的基因向其他生物扩散C.减少杀虫剂对环境的破坏D.改变现有生态结构解析（1）EβF属于化学信息,薄荷利用EβF驱散蚜虫并吸引蚜虫的天敌,体现了生态系统的信息传递具有调节生物种间关系, 以维持生态系统稳定性的功能.（2）PCR反应体系中需加入Taq酶、模板序列（EβF合成酶基因）、4种脱氧核苷酸及两种引物.利用mRNA可以通过反转录法获取目的基因.（3）目的基因上SalⅠ切割产生的末端为—AGCT,质粒上XhoⅠ切割产生的末端也为TCGA—,两者黏性末端相同,可以连接,连接点的碱基序列变为…GTCGAG……CAGCTC…,不是两种限制酶的识别序列,不能被这两种限制酶中的某一种切割.答案（1）调节生物的种间关系（2）（耐高温的）DNA聚合酶（或Taq酶）引物反转录（3）XhoⅠ不能（4）停留时间天敌数量（5）BD3.嗜热菌可以生活在98 ℃的高温环境中,研究发现其耐热性与基因H的表达产物有关.下图表示某研究小组利用大肠杆菌对H基因实行的克隆和表达过程,其中NdeⅠ、Eco RⅠ、Hin dⅢ、SalⅠ四种限制酶的识别序列和酶切位点分别为CA↓TATG、G↓AATTC、A↓AGCTT、G↓TCGAC.请分析回答:（1）图中的结构A是,其主要作用是.一个完整的基因表达载体组成,除了质粒1中所示结构以外,还应该含有_____________________________________________________________________ .（2）用图中质粒1和H基因构建重组质粒,应选用两种限制酶进行切割,影响限制酶处理效果的因素可能有（多选）.①反应温度②缓冲液pH③限制酶的浓度④DNA样品的纯度（3）PCR反应中引物的设计非常关键,据图分析,扩增H基因时应选择的一对引物是.（多选）A.引物Ⅰ:…GGGAATTC…；引物Ⅱ:…CTCATATG…B.引物Ⅰ:…GAATTCCC…；引物Ⅱ:…CATATGAG…C.引物Ⅰ:…GGAAGCTT…；引物Ⅱ:…AAGCTTCC…D.引物Ⅰ:…CTCATATG…；引物Ⅱ:…AAGCTTAAGCTT…解析（1）据题图分析,由质粒1的结构及质粒1和重组质粒上都具有A可推知,A 是启动子,其作用是提供RNA聚合酶特异性识别结合位点,驱动基因转录.一个完整的基因表达载体组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因,而质粒1中已经含有启动子和标记基因（抗生素A抗性基因）,故答案是目的基因、终止子. （2）结合四种限制酶的识别序列和酶切位点,确定用图中质粒1和H基因构建重组质粒,应选用NdeⅠ、Eco R Ⅰ两种限制酶进行切割,影响酶的因素都影响限制酶的处理效果,所以可能有温度、pH、酶浓度和底物的纯度,即①②③④.（3）分析切割质粒和目的基因的两种限制酶NdeⅠ、Eco RⅠ的识别序列和切割位点,发现A、B选项的引物Ⅱ中有NdeⅠ的识别序列CA↓TATG,而A、B选项的引物Ⅰ中都有Eco RⅠ的识别序列G↓AATTC,而C、D中都不含,所以应选择A、B.答案（1）启动子提供RNA聚合酶特异性识别结合位点目的基因、终止子（和复制原点）（2）NdeⅠ、Eco RⅠ①②③④（3）AB4.（2018·苏锡常镇三模）基因工程中,GUS基因编码的酶可将无色底物生成蓝色产物,GFP基因会产生绿色荧光蛋白,这两种基因都可作为标记基因来研究发育生物学的问题.利用双CRISPR/Cas9系统和Cre/loxP重组酶系统技术可更好地实现该研究.请据图作答:（1）图1为双CRISPR/Cas9系统作用示意图.该系统能够特异性识别DNA序列并切割特定位点的原因分别是、.图中向导RNA与DNA结合的原理是.将删除区切割后,转入基因与原DNA片段可通过形成拼接起来,形成新的DNA序列.（2）双CRISPR/Cas9系统可直接在靶细胞内起作用,与传统的基因工程相比,该操作无需（填工具）.与质粒载体导入外源基因比,双CRISPR/Cas9系统编辑的基因可以不含.（3）图2为Cre/loxP重组酶系统作用示意图.利用双CRISPR/Cas9系统可精准地将loxP序列、GUS基因及GFP基因连接,接上35S启动子之后可在组织中检测出蓝色区而无绿色荧光区,这是由于基因自身无启动子而无法表达.Cre基因是重组酶基因,经38 ℃热处理后可被激活表达,在此前提下组织中可检测出绿色荧光区,据此分析绿色荧光区形成的原因是.采用等技术手段可以扩大组织中绿色荧光区的面积.解析（1）图1中向导RNA有识别序列,能识别特定序列,Cas9 蛋白能定点切割DNA序列,所以该系统能够特异性识别DNA序列并切割特定位点.图中向导RNA可以与DNA发生碱基互补配对而结合.切割删除区后,转入的基因与原DNA 片段可形成磷酸二酯键拼接成新的DNA序列.（2）传统的基因工程需要载体将目的基因导入受体细胞,而双CRISPR/Cas9系统可直接在靶细胞内起作用,不需要载体.质粒载体导入外源基因需要含启动子、终止子和标记基因,而双CRISPR/Cas9系统编辑的基因不需要载体,可以不含启动子、终止子和标记基因.（3）loxP序列、GUS基因及GFP基因连接,接上35S启动子之后,GUS基因可以转录从而编码出酶将无色底物生成蓝色产物,而GFP基因自身无启动子无法表达绿色荧光蛋白,所以在组织中可以检测出蓝色区而无绿色荧光区.经38 ℃热处理后Cre重组酶基因被激活表达,特异性识别切割loxP 序列,使GFP基因接上35S 启动子得以表达,组织中可检测出绿色荧光区,所以延长热处理时间可以扩大组织中绿色荧光区的面积.答案（1）向导RNA能识别特定序列Cas9 蛋白能定点切割DNA序列碱基互补配对磷酸二酯键（2）载体启动子、终止子和标记基因（3）GFP 重组酶能（特异性识别并）切割loxP 序列,使GFP基因得以表达延长热处理时间。

高中生物基因工程知识点总结基因工程是现代生物技术的核心内容之一，对于我们理解生命的奥秘和解决现实中的许多问题具有重要意义。

接下来，让我们一起深入学习高中生物中基因工程的相关知识点。

一、基因工程的概念基因工程，又称为 DNA 重组技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

二、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）这是基因工程中的“剪刀”，能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。

限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。

2、 DNA 连接酶它是基因工程中的“针线”，能将两个具有相同末端的 DNA 片段连接起来。

3、运载体常见的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。

运载体需要具备的条件包括：能够在宿主细胞中稳定保存并自我复制；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有标记基因，便于筛选含有目的基因的受体细胞。

三、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以通过人工合成的方法获取。

常用的方法有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增目的基因等。

2、基因表达载体的构建这是基因工程的核心步骤。

目的基因与运载体结合形成重组 DNA 分子，这个过程需要用到限制酶和 DNA 连接酶。

重组 DNA 分子除了包含目的基因外，还需要有启动子、终止子和标记基因等元件。

3、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；导入动物细胞常用的方法是显微注射法；导入微生物细胞则常用感受态细胞法。

4、目的基因的检测与鉴定目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，需要进行检测与鉴定。

检测的方法包括分子水平的检测和个体水平的鉴定。

限制酶选择的三大依据1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类图1(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ(目的基因两端均具PstⅠ)。

(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。

(2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。

2.根据质粒的特点确定限制酶的种类(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。

(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2中KpnⅠ)。

如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

(4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中Hin dⅢ会破坏启动子，Eco RⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。

3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。

如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。

若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。

(分析如下)1.(2016·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam HⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

限制酶选择的三大依据1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类图1（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ（目的基因两端均具PstⅠ）。

（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。

（2）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。

2.根据质粒的特点确定限制酶的种类（1）所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

（2）质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。

（3）所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点（如图2中KpnⅠ）。

如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

（4）所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中Hin dⅢ会破坏启动子，Eco RⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。

3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。

如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。

若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。

（分析如下）1.（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam HⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

高中生物基因工程知识点总结基因工程是现代生物技术的核心领域之一，在高中生物课程中占据着重要的地位。

它是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

接下来，我们将对高中生物基因工程的相关知识点进行详细总结。

一、基因工程的工具1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）限制酶能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

限制酶具有特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。

2、 DNA 连接酶DNA 连接酶的作用是将两个具有相同末端的 DNA 片段连接起来，形成磷酸二酯键。

常用的 DNA 连接酶有 E·coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。

3、载体载体的作用是将目的基因导入受体细胞。

常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

载体需要具备的条件包括：能够在受体细胞中复制并稳定保存；具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有标记基因，便于重组 DNA 的鉴定和选择。

二、基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取目的基因是指人们所需要的编码蛋白质的结构基因。

获取目的基因的方法主要有从基因文库中获取、利用 PCR 技术扩增目的基因和人工合成法。

从基因文库中获取目的基因是指将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。

可以根据目的基因的有关信息，从基因文库中获取目的基因。

PCR 技术全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。

利用 PCR 技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。

人工合成法包括反转录法和化学合成法。

反转录法是以目的基因转录的 mRNA 为模板，反转录成互补的单链 DNA，然后在酶的作用下合成双链 DNA。

高中生物：限制酶知识点限制酶是一种在分子生物学领域中广泛使用的工具，它在DNA分析和基因工程中起着重要的作用。

本文将介绍限制酶的定义、作用机制、分类以及在实验室中的应用。

一、定义限制酶，又称为切割酶，是一类能够识别特定DNA序列并将其切割为特定片段的酶。

它们是一类天然存在于细菌和古菌中的酶，用于保护细菌免受入侵的外源DNA（例如噬菌体）的攻击。

二、作用机制限制酶通过识别特定的DNA序列，称为限制性核酸位点（restriction sites），并在该位点上切割DNA链。

限制酶能够识别的核酸位点通常是对称的，例如5’ - GAATTC - 3’和3’ - CTTAAG - 5’，它们在正反两条链上具有相同的序列。

当限制酶识别到这样的位点时，它会切割DNA链，产生两个断裂的DNA链。

三、分类根据限制酶的作用机制和识别位点的序列，限制酶可以分为不同的类别。

常见的限制酶有： 1. I型限制酶：这类限制酶能够识别DNA序列，但切割位点并不紧邻其识别位点。

它们通常需要辅助蛋白质的帮助来完成切割作用。

2. II型限制酶：这类限制酶能够直接识别并切割DNA链。

它们识别的核酸位点通常是对称的，并且切割位点在限制性核酸位点的附近。

II型限制酶是最为常见和广泛应用的限制酶。

3. III型限制酶：这类限制酶与I型限制酶类似，也需要辅助蛋白质来完成切割作用。

它们与I型限制酶的主要区别在于，识别位点和切割位点之间存在一定的距离。

四、实验室应用限制酶在实验室中被广泛应用于分子生物学和基因工程领域。

以下是一些常见的应用： 1. DNA切割：限制酶可以用于将DNA切割为特定的片段。

通过使用不同的限制酶组合，可以得到不同长度的DNA片段，用于DNA分析和构建基因库等。

2. DNA连接：限制酶也可以用于将不同的DNA片段连接起来。

通过选择适当的限制酶和连接酶，可以将不同的DNA片段组装成目标序列。

3. DNA标记：有些限制酶能够在切割DNA链的同时，在切割位点的末端引入特定的序列（例如蛋白质识别位点或荧光标记）。

第三章基因工程知识点梳理第一节重组DNA技术的基本工具1.实施基因工程的最终目的：定向改造生物的遗传性状2.DNA酶的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为它的基本单位脱氧核苷酸3.限制酶（限制性内切核酸酶）的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为DNA分子的片段4.DNA连接酶的作用：能连接两个具有碱基互补配对的DNA片段之间的磷酸二酯键5.DNA聚合酶的作用：能把游离的脱氧核苷酸连接在引物的3，端6.解旋酶的作用：断开DNA两条链之间的氢键7.基因工程的基本工具：（1）分子手术刀—限制性内切核酸酶简称限制酶功能：识别和断开DNA分子的特定核苷酸序列如：EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：GAATTC，断开G,A之间的磷酸二之间,形成黏性末端Sma1EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：CCCGGG，断开C,G之间的磷酸二之间,形成平末端（2）分子缝合针—DNA连接酶功能：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。

DNA连接酶有上千种，可以分为两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的E.coliDNA连接酶，只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。

T4DNA 连接酶既可以缝合黏性末端又可以缝合平末端，但连接平末端的效率相对较低。

（3）分子运输车—基因进入受体细胞的载体外源基因怎样送入细胞? 通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。

8.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。

在基因工程中使用的载体除了质粒还有噬菌体，动植物病毒等。

9.成为载体的条件：（1）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制（2）有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选。

（3）有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中（4）对受体细胞无害10.DNA的粗提取与鉴定（1）选择富含DNA的生物组织使细胞内容物溶出。