原核表达宿主菌株选择

原核蛋白表达常见问题解析1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。

经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。

虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。

实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。

2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。

以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。

另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。

3、如何选择蛋白表达宿主菌？4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。

1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。

2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。

（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。

此方法能快速得到蛋白。

（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。

重组质粒的诱导表达——表达宿主菌以及诱导表达
1.表达宿主菌的选择
大肠杆菌常用的表达宿主菌有E.Coli BL21(DE3), E.Coli Rossatta(DE3), E.Coli BL21(DE3)Condon Plus。

针对特殊的目标蛋白其所需要的宿主菌也不相同，每种宿主菌的基本特征可在本网站查询，福因德生物可提供表中所列菌种的感受态细胞，如需更多信息可联系福因德技术部门。

2．优化表达条件
表达条件(包括IPTG浓度、诱导温度和和诱导时间等)的优化（可参照以下的正交图设计实验），主要是为了提高蛋白产量/提高可溶性蛋白表达比例；选用不同诱导时长主要是为了选择最佳收获时间（时间短了，蛋白产量不够；时间长了，大量蛋白降解）；温度诱导主要是为了得到可溶性表达的蛋白，很多的蛋白即使低温诱导也不能实现可溶性表达，一定要实现可溶性表达尽可能选择促溶标签/调整IPTG浓度，使翻译速度放缓有充分时间折叠。

福因德生物技术团队研发的自诱导培养基（Frdbio T7表达自诱导培养基即用型，PER0011）就是充分利用此原理，对表达在包涵体状态的蛋白优化为上清可溶表达状态的成功率高达60%。

可溶性表达的策略在“蛋白可溶性表达的解决方案”中有详细的阐述。

大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。

表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。

大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。

据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。

与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。

常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。

该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。

大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。

宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。

其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。

酶的克隆与表达 原核表达系统Company Logo优点： 易于生长和控制 用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的 质粒可供选择 缺点： 在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少糖基化修饰等 常形成包涵体Company Logo微生物表达系统3Company LogoCompany Logo选择标 志的编 码序列可控转 录的启 动子转录调控序 列(转录终止 子，核糖体 结合位点）多限制酶切 位点接头宿主体内 自主复制 的序列表达载体表达载体在基因工程中具有十分重要的作 用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达 载体应具有以上几种元件Company Logo核糖体结合位点 启动子 转录终止子复制 起点Company LogoCompany Logo外源蛋白高效表达的三要素 基因载体宿主基因是根本，载体是关键，宿主是外因8Company Logo一个合适表达载体（质粒）的构件1. 筛选标记 Amp，Kan，Tet 2. 可控的启动子lac，lacUV5, trp，trc, tac，λPL，T73．翻译起始区 RBS，Met 4．多克隆位点（MCS） NdeI，EcoRI，SalI, SmaI起始子*活性同尾酶t同裂酶Company Logo95．终止子 6．融合标签（分离、分析、质量） AP: 亲和层析 IP: 免疫沉淀 QA: 定量分析 DB: 二硫键形成 PE: 蛋白质输出 SP: 可溶性蛋白 DI: 二硫键异构 PP: 小蛋白/多肽生产 PS: 体外磷酸化 WB: 免疫印迹 IF: 免疫荧光10Company Logo筛选标记Amp(氨苄青霉素抗性基因，bla)启动子结构示意图Promoters recognized by E. coli RNA polymerase containing σ70启动子lac启动子负调控模型示意图双信号调控模型启动子trp色氨酸操纵子结构tac启动子tac由trp和lacUV5杂合而成。

原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。

②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。

③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。

在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。

2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。

二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。

一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。

变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。

只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。

做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。

2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。

（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。

（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。

所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。

3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。

原核表达感受态细胞选用指南1.Trans BL21(DE3) pLysS （适合有毒蛋白的表达）•产品说明Trans BL21(DE3) pLysS化学感受态细胞经特殊工艺制作，可用于DNA的化学转化。

细胞具有氯霉素(Camr)抗性。

使用pUC19质粒DNA检测，转化效率高达107 cfu/μg DNA。

使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能，表达蛋白大小为25 kDa。

•特点：该菌株带有质粒pLysS，具有氯霉素抗性。

此质粒含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。

该菌株适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。

2.BL21（DE3）（实验室传统感受态细胞）•产品说明Trans BL21(DE3)化学感受态细胞经特殊工艺制作，可用于DNA的化学转化。

使用pUC19质粒DNA检测，转化效率高达107 cfu/μg DNA。

使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能，表达蛋白大小为25 kDa。

•特点：该菌株用于T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。

该菌株适合于非毒性蛋白的表达。

3.Transetta（DE3）（适合稀有密码子序列的表达）（表达量高，无特殊要求的推荐优先选用）•产品说明Transetta（DE3）是采用进口菌株，特殊工艺制作，可用于DNA的化学转化。

细胞具有氯霉素(Camr)抗性。

使用pUC19质粒DNA检测，转化效率可达107 cfu/μg DNA。

使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能，表达蛋白大小为25 kDa。

•特点：该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA）对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。

大肠杆菌表达纯化蛋白大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究中。

它具有较高的生长速度、易于培养和操作的特点，被广泛用于表达和纯化蛋白。

本文将从大肠杆菌的选择、蛋白表达、纯化等方面介绍如何利用大肠杆菌表达纯化蛋白。

一、大肠杆菌的选择在大肠杆菌中选择合适的表达宿主菌株至关重要。

一般而言，常用的宿主菌株有BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。

这些菌株具有较高的蛋白表达能力和稳定性，适合用于表达多种蛋白。

根据所需表达的蛋白的特点（例如毒性、折叠状态等），选择合适的宿主菌株是必要的。

二、蛋白表达蛋白表达是指通过转化目标基因到大肠杆菌中，使其表达目标蛋白。

一般采用的方法有原核表达和真核表达两种。

原核表达是将目标基因插入表达质粒，然后转化到大肠杆菌中，利用大肠杆菌的细胞机制进行蛋白表达。

真核表达则是将目标基因转化到真核细胞中，利用真核细胞的转录和翻译系统进行蛋白表达。

在大肠杆菌中进行蛋白表达时，需要选择适当的表达质粒。

常用的表达质粒有pET系列、pGEX系列等。

这些质粒通常含有启动子、多克隆位点、选择标记等功能元件，能够实现高效的蛋白表达。

在构建表达质粒时，需要将目标基因插入适当的位点，确保目标蛋白能够被正常表达。

三、蛋白纯化蛋白表达后，需要对目标蛋白进行纯化。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

亲和层析是利用蛋白与亲和树脂之间的特异性相互作用进行纯化的方法。

离子交换层析则是利用蛋白与离子交换树脂之间的电荷相互作用进行纯化的方法。

凝胶过滤层析则是利用蛋白在凝胶中的分子大小差异进行纯化的方法。

在进行蛋白纯化时，需要根据目标蛋白的特性选择合适的纯化方法。

不同的纯化方法具有不同的选择条件和操作步骤，需要根据实际情况进行选择。

此外，为了提高纯化效果，还可以采用多步骤的纯化策略，如串联多个纯化方法，以获得更高纯度的蛋白。

四、蛋白质结构分析在蛋白纯化后，可以对目标蛋白进行结构分析。

原核表达目的蛋白的方法原核表达目的蛋白的方法1. 引言原核表达是一种常用的表达蛋白质的方法，其主要基于原核细胞（如大肠杆菌）的天然表达系统。

通过使用不同的表达载体和相关技术，研究人员可以将目的蛋白质在原核细胞中高效表达，并借此进行产量大、成本低的蛋白质生产。

2. 选择合适的表达载体在原核表达中，选择合适的表达载体是非常重要的。

常见的表达载体有质粒和噬菌体。

质粒表达系统依赖于质粒DNA在细胞内的复制和转录作用，噬菌体表达系统则是通过感染细胞引起的溶菌作用来释放表达产物。

根据需求和实验目的，可以选择适当的表达载体。

3. 选择适当的表达宿主常用的原核表达宿主是大肠杆菌，因其具有较强的表达能力和简单的培养条件。

其他一些菌株如酵母、双歧杆菌等也可以用于原核表达。

根据目的蛋白的特性和表达要求，选择合适的表达宿主。

4. 优化基因序列在进行原核表达之前，需要对目的蛋白的基因序列进行优化。

合成较高优化的核酸序列，包括优化翻译起始子和优化密码子使用。

这样可以提高蛋白质的表达水平和折叠状态。

5. 转化目的蛋白质转化是指将目的蛋白质基因导入表达宿主中的过程。

最常用的方法是通过化学转化或电转化将表达载体导入细胞。

还可以利用病毒、质粒导弹等方法进行转化，具体选择方法取决于实验需求和表达系统。

6. 诱导表达转化后，需要选择适当的诱导方法来激活表达载体中的目的蛋白基因。

常用的诱导剂有异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、丝氨酸酶等。

根据表达宿主和表达载体的不同，可选择不同的诱导浓度和诱导时间。

7. 提取和纯化目的蛋白经过表达和诱导后，目的蛋白质可在细胞内或细胞外表达。

具体提取和纯化方法可以根据蛋白质的特性和需求选择，常用的方法包括离心法、柱层析法、亲和层析法等。

8. 评估表达蛋白质的性质和功能通过一系列生化、免疫学、生物学等实验方法，可以对表达蛋白质的性质和功能进行评估。

可以利用SDS-PAGE检测蛋白质的表达水平和相对分子质量。