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原核蛋白表达常见问题解析1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。
经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。
虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。
实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。
2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。
以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。
另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。
3、如何选择蛋白表达宿主菌？4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶回收三类。
1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。
2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。
（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。
此方法能快速得到蛋白。
（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。
重组质粒的诱导表达——表达宿主菌以及诱导表达
1.表达宿主菌的选择
大肠杆菌常用的表达宿主菌有E.Coli BL21(DE3), E.Coli Rossatta(DE3), E.Coli BL21(DE3)Condon Plus。
针对特殊的目标蛋白其所需要的宿主菌也不相同，每种宿主菌的基本特征可在本网站查询，福因德生物可提供表中所列菌种的感受态细胞，如需更多信息可联系福因德技术部门。
2．优化表达条件
表达条件(包括IPTG浓度、诱导温度和和诱导时间等)的优化（可参照以下的正交图设计实验），主要是为了提高蛋白产量/提高可溶性蛋白表达比例；选用不同诱导时长主要是为了选择最佳收获时间（时间短了，蛋白产量不够；时间长了，大量蛋白降解）；温度诱导主要是为了得到可溶性表达的蛋白，很多的蛋白即使低温诱导也不能实现可溶性表达，一定要实现可溶性表达尽可能选择促溶标签/调整IPTG浓度，使翻译速度放缓有充分时间折叠。
福因德生物技术团队研发的自诱导培养基（Frdbio T7表达自诱导培养基即用型，PER0011）就是充分利用此原理，对表达在包涵体状态的蛋白优化为上清可溶表达状态的成功率高达60%。
可溶性表达的策略在“蛋白可溶性表达的解决方案”中有详细的阐述。
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
酶的克隆与表达 原核表达系统Company Logo优点： 易于生长和控制 用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵 有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的 质粒可供选择 缺点： 在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少糖基化修饰等 常形成包涵体Company Logo微生物表达系统3Company LogoCompany Logo选择标 志的编 码序列可控转 录的启 动子转录调控序 列(转录终止 子，核糖体 结合位点）多限制酶切 位点接头宿主体内 自主复制 的序列表达载体表达载体在基因工程中具有十分重要的作 用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达 载体应具有以上几种元件Company Logo核糖体结合位点 启动子 转录终止子复制 起点Company LogoCompany Logo外源蛋白高效表达的三要素 基因载体宿主基因是根本，载体是关键，宿主是外因8Company Logo一个合适表达载体（质粒）的构件1. 筛选标记 Amp，Kan，Tet 2. 可控的启动子lac，lacUV5, trp，trc, tac，λPL，T73．翻译起始区 RBS，Met 4．多克隆位点（MCS） NdeI，EcoRI，SalI, SmaI起始子*活性同尾酶t同裂酶Company Logo95．终止子 6．融合标签（分离、分析、质量） AP: 亲和层析 IP: 免疫沉淀 QA: 定量分析 DB: 二硫键形成 PE: 蛋白质输出 SP: 可溶性蛋白 DI: 二硫键异构 PP: 小蛋白/多肽生产 PS: 体外磷酸化 WB: 免疫印迹 IF: 免疫荧光10Company Logo筛选标记Amp(氨苄青霉素抗性基因，bla)启动子结构示意图Promoters recognized by E. coli RNA polymerase containing σ70启动子lac启动子负调控模型示意图双信号调控模型启动子trp色氨酸操纵子结构tac启动子tac由trp和lacUV5杂合而成。
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达感受态细胞选用指南1.Trans BL21(DE3) pLysS （适合有毒蛋白的表达）•产品说明Trans BL21(DE3) pLysS化学感受态细胞经特殊工艺制作，可用于DNA的化学转化。
细胞具有氯霉素(Camr)抗性。
使用pUC19质粒DNA检测，转化效率高达107 cfu/μg DNA。
使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能，表达蛋白大小为25 kDa。
•特点：该菌株带有质粒pLysS，具有氯霉素抗性。
此质粒含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。
该菌株适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。
2.BL21（DE3）（实验室传统感受态细胞）•产品说明Trans BL21(DE3)化学感受态细胞经特殊工艺制作，可用于DNA的化学转化。
使用pUC19质粒DNA检测，转化效率高达107 cfu/μg DNA。
使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能，表达蛋白大小为25 kDa。
•特点：该菌株用于T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主，T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。
该菌株适合于非毒性蛋白的表达。
3.Transetta（DE3）（适合稀有密码子序列的表达）（表达量高，无特殊要求的推荐优先选用）•产品说明Transetta（DE3）是采用进口菌株，特殊工艺制作，可用于DNA的化学转化。
细胞具有氯霉素(Camr)抗性。
使用pUC19质粒DNA检测，转化效率可达107 cfu/μg DNA。
使用Control Plasmid I (Amp+)用于检测细胞是否具有表达功能，表达蛋白大小为25 kDa。
•特点：该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA）对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
大肠杆菌表达纯化蛋白大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究中。
它具有较高的生长速度、易于培养和操作的特点，被广泛用于表达和纯化蛋白。
本文将从大肠杆菌的选择、蛋白表达、纯化等方面介绍如何利用大肠杆菌表达纯化蛋白。
一、大肠杆菌的选择在大肠杆菌中选择合适的表达宿主菌株至关重要。
一般而言，常用的宿主菌株有BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)等。
这些菌株具有较高的蛋白表达能力和稳定性，适合用于表达多种蛋白。
根据所需表达的蛋白的特点（例如毒性、折叠状态等），选择合适的宿主菌株是必要的。
二、蛋白表达蛋白表达是指通过转化目标基因到大肠杆菌中，使其表达目标蛋白。
一般采用的方法有原核表达和真核表达两种。
原核表达是将目标基因插入表达质粒，然后转化到大肠杆菌中，利用大肠杆菌的细胞机制进行蛋白表达。
真核表达则是将目标基因转化到真核细胞中，利用真核细胞的转录和翻译系统进行蛋白表达。
在大肠杆菌中进行蛋白表达时，需要选择适当的表达质粒。
常用的表达质粒有pET系列、pGEX系列等。
这些质粒通常含有启动子、多克隆位点、选择标记等功能元件，能够实现高效的蛋白表达。
在构建表达质粒时，需要将目标基因插入适当的位点，确保目标蛋白能够被正常表达。
三、蛋白纯化蛋白表达后，需要对目标蛋白进行纯化。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
亲和层析是利用蛋白与亲和树脂之间的特异性相互作用进行纯化的方法。
离子交换层析则是利用蛋白与离子交换树脂之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
凝胶过滤层析则是利用蛋白在凝胶中的分子大小差异进行纯化的方法。
在进行蛋白纯化时，需要根据目标蛋白的特性选择合适的纯化方法。
不同的纯化方法具有不同的选择条件和操作步骤，需要根据实际情况进行选择。
此外，为了提高纯化效果，还可以采用多步骤的纯化策略，如串联多个纯化方法，以获得更高纯度的蛋白。
四、蛋白质结构分析在蛋白纯化后，可以对目标蛋白进行结构分析。
原核表达目的蛋白的方法原核表达目的蛋白的方法1. 引言原核表达是一种常用的表达蛋白质的方法，其主要基于原核细胞（如大肠杆菌）的天然表达系统。
通过使用不同的表达载体和相关技术，研究人员可以将目的蛋白质在原核细胞中高效表达，并借此进行产量大、成本低的蛋白质生产。
2. 选择合适的表达载体在原核表达中，选择合适的表达载体是非常重要的。
常见的表达载体有质粒和噬菌体。
质粒表达系统依赖于质粒DNA在细胞内的复制和转录作用，噬菌体表达系统则是通过感染细胞引起的溶菌作用来释放表达产物。
根据需求和实验目的，可以选择适当的表达载体。
3. 选择适当的表达宿主常用的原核表达宿主是大肠杆菌，因其具有较强的表达能力和简单的培养条件。
其他一些菌株如酵母、双歧杆菌等也可以用于原核表达。
根据目的蛋白的特性和表达要求，选择合适的表达宿主。
4. 优化基因序列在进行原核表达之前，需要对目的蛋白的基因序列进行优化。
合成较高优化的核酸序列，包括优化翻译起始子和优化密码子使用。
这样可以提高蛋白质的表达水平和折叠状态。
5. 转化目的蛋白质转化是指将目的蛋白质基因导入表达宿主中的过程。
最常用的方法是通过化学转化或电转化将表达载体导入细胞。
还可以利用病毒、质粒导弹等方法进行转化，具体选择方法取决于实验需求和表达系统。
6. 诱导表达转化后，需要选择适当的诱导方法来激活表达载体中的目的蛋白基因。
常用的诱导剂有异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、丝氨酸酶等。
根据表达宿主和表达载体的不同，可选择不同的诱导浓度和诱导时间。
7. 提取和纯化目的蛋白经过表达和诱导后，目的蛋白质可在细胞内或细胞外表达。
具体提取和纯化方法可以根据蛋白质的特性和需求选择，常用的方法包括离心法、柱层析法、亲和层析法等。
8. 评估表达蛋白质的性质和功能通过一系列生化、免疫学、生物学等实验方法，可以对表达蛋白质的性质和功能进行评估。
可以利用SDS-PAGE检测蛋白质的表达水平和相对分子质量。
一、实验前的分析目的：得到5mg纯目的蛋白，并制备一抗。
1、载体选择pET系列：目标基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌。
优点：·是原核蛋白表达引用最多的系统·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低·真正的调节表达水平的“变阻器”控制·提供各种不同融合标签和表达系统配置·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR产物·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化T7 lac 启动子在启动子区下游17bp 处含有一个25bp 的lac 操纵序列。
该位点结合lac 阻遏蛋白能够有效降低T7 RNA 聚合酶的转录（如果宿主菌DE3有pLysS或pLysE 的，亦可抑制T7RNA聚合酶的转录）。
除了根据载体/ 宿主菌组合控制T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性，pET 系统还根据诱导物( IPTG )浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。
pET 载体表达的蛋白用途：表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备；大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备；许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。
pET-30a-c(+) T7-lac Kan N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen(详细信息参考载体具体信息)2、引物设计载体一般都带有起始密码子和终止密码子，可以不另加，另外注意不要移码，还要看一下目的蛋白含不含信号肽，看情况选择是否去掉。
3、载体选择BL21是应用最广的宿主菌来源，具有lon 和ompT 蛋白酶缺陷的优点。
基因⼯程的表达载体——原核细胞表达载体（2）-PL和PR启动⼦表达载体系统PL和PR启动⼦表达载体系统P L和P R启动⼦是⼤肠杆菌λ噬菌体中控制早期转录的启动⼦， P L和P R表达载体系统是以该启动⼦构建的⾼效表达载体。
在野⽣型λ噬菌体中，P L和P R启动⼦的转录与否决定λ噬菌体进⼊裂解循环或溶原循环。
λ噬菌体P E启动⼦控制的CI基因表达产物是P L和P R启动⼦转录的阻遏物，⽽CI阻遏物的表达和在细胞中的浓度，取决于⼀系列宿主与噬菌体因⼦之间的复杂平衡关系。
由于通过细胞因⼦调节CI在细胞中含量的途径很难操作，因⽽在构建表达系统时，选⽤温度敏感突变体CIts857的基因产物来调控P L和P R启动⼦的转录, 在较低温度(30)下阻遏物以活性形式存在，在较⾼温度(42)下阻遏作⽤失活。
因此，改变⼯程菌的培养温度即可控制⽬的基因的表达，这⽐⽤诱导剂诱导表达的系统要节省操作步骤和成本，在⼤规模基因表达中优点尤其明显。
由于普通的⼤肠杆菌中不含CI基因表达产物，因此必须对表达载体或⼤肠杆菌进⾏遗传改造，将CIts857基因组装在表达载体上或整合在宿主染⾊体上。
本⾝带有CIts857基因的表达载体，能⾃⾝编码CIts蛋⽩，对宿主的选择范围较宽；本⾝不带CIts857基因的表达载体，选择宿主菌时，要求宿主是有缺陷的原噬菌体溶源化的菌株(如M5219)。
前⼀类载体表达效率往往更⾼。
图⽰为pBV220表达载体的结构⽰意图。
⾎管⽣长素(ANG)基因插⼊pB220载体多克隆位点中，转化到⼤肠杆菌JM103内，便能通过温度的变换控制CI阻遏蛋⽩的活性，继⽽调节P L和P R启动⼦的活性，使ANG基因连同其5′端上游所带的SD 序列转录成mRNA (SD序列与起始密码ATG的间距为6bp)，mRNA作为模板使核糖体⾼效翻译出ANG产物，并终⽌于rrnB位点。
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。
对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA 提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
~复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。
表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为获得具有良好抗原性的猪圆环病毒3型（PCV3）Cap 重组蛋白，根据本实验室已测序获得的1株全基因组序列设计特异性引物，以阳性病料中提取的病毒DNA 基因组为模板，通过PCR 方法扩增得到PCV3的去核定位信号的Cap 蛋白基因，将目的片段插入到pCold TF 载体中构建pCold TF-dPCV3-Cap 重组质粒，然后将其转化至表达宿主菌BL21（DE3）中，通过优化表达和纯化条件，最终获得纯度较高的Cap 重组蛋白。
SDS-PAGE 分析表明，该蛋白能够在上清液中大量表达，并且在IPTG 终浓度为1 mmol/mL 、16℃诱导20 h 的条件下表达量最高；Western blot 结果证实通过磁珠纯化后的目的蛋白与PCV3阳性血清能够发生特异性反应。
因此，重组Cap 蛋白具有良好的反应原性和特异性，可以作为研制PCV3多表位基因工程疫苗和血清抗体诊断方法的候选靶抗原。
关键词：猪圆环病毒3型；原核表达；Cap 蛋白中图分类号： S852.659.2文献标志码：A文章编号：1674-6422（2021）05-0059-05Prokaryotic Expression and Antigenic Analysis of Cap Protein of Porcine Circovirus Type 3W ANG Shuaiyong, W ANG Qi, ZHU Shiqiang, Y AO Y un, YU Lingxue, LIU Xiaomin, SHAN Tongling,ZHENG Hao, ZHOU Yanjun, TONG Wu, LI Guoxin, GAO Fei, TONG Guangzhi, YU Hai(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241,China)收稿日期：2019-04-19基金项目：上海市自然科学基金青年项目（16ZR1444000）；中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（2019JB05）；中国农业科学院创新工程“猪病毒性繁殖障碍综合症团队”项目作者简介：王帅勇，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：猪圆环病毒3型Cap 蛋白的原核表达王帅勇，汪 琪，朱世强，姚 云，虞凌雪，刘晓敏，单同领，郑 浩，周艳君，童 武，李国新，高 飞，童光志，于 海（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）2021,29(5): 59-63Abstract: According to the complete genomic sequence of Porcine circovirus type 3 (PCV3) that was isolated in our laboratory, a pair of specifi c PCR primers were designed and the nuclear localization signal-defected capsid protein gene was amplifi ed by PCR for prokaryotic expression. The PCR product was inserted into the pCold TF vector to construct the recombinant plasmid pCold TF-dPCV3-Cap, which was then transformed into expression host strain BL21(DE3) with IPTG induction. The expressed fusion protein was analyzed by SDS-PAGE. The results showed that the recombinant Cap protein was expressed and released into the supernatants in soluble form. The optical conditions for the Cap protein expression were determined to be 16℃, 1 mmol/mL IPTG and induction for 24 h. The Cap protein was purifi ed by using magnetic beads and antigenic analysis was carried out by Western blot. The results demonstrated that the Cap protein obtained had good antigenicity and specifi city.Key words: Porcine circovirus type 3; prokaryotic expression; Cap protein· 60 ·中国动物传染病学报2021年10月猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，是一种单股环状DNA病毒。
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
菌株1：DH5a菌株DH5a是⼀种常⽤于质粒克隆的菌株。
E.coli DH5a在使⽤pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。
可⽤于蓝⽩斑筛选鉴别重组菌株。
基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株⽤于⾼效表达克隆于含有噬菌体T7启动⼦的表达载体（如pET系列）的基因。
T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染⾊体上。
该菌适合表达⾮毒性蛋⽩。
基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。
PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低⽬的基因的背景表达⽔平，但不⼲扰⽬的蛋⽩的表达。
该菌适合表达毒性蛋⽩和⾮毒性蛋⽩。
基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr4：JM109菌株该菌株在使⽤pUC系列质粒载体进⾏DNA转化或⽤M13 phage载体进⾏转染时，由于载体DNA产⽣的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进⾏α－互补，从⽽显⽰β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5：TOP10菌株该菌株适⽤于⾼效的DNA克隆和质粒扩增，能保证⾼拷贝质粒的稳定遗传。
基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使⽤⽅便，适⽤于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-17：M110或SCS110⼤多数⼤肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GA TC序列中腺嘌呤N-6位上引⼊甲基，后者在CCA/TGC序列的第⼀个胞嘧啶C-5位置上引⼊甲基。
