HBV耐药基因突变检测

1. HBV 常见变异位点及相关药物现阶段核苷(酸)类似药物被用于临床抗乙型肝炎病毒的主要是拉米夫定（LAM ）、恩替卡韦（ETV ）、 替比夫定（LdT ）、恩曲他滨（FTC ）、阿德福韦（ADV ）等几种药物,其中拉米夫定（LAM ）耐药变异位点为V173L 、L180M 、A181V/T 、M204V/I/S 等位点的变异，恩替卡韦（ETV ）耐药变异位点为I169T 、T184A/G/I/S 、L180M 、S202G/I 、M204V/I/S 、M250V 等，替比夫定（LdT ）耐药变异位点常见L180M 、A181V/T 、M204V/I/S ，恩曲他滨（FTC ）耐药变异位点多见于V173L 、L180M 、M204V/I/S ，阿德福韦（ADV ）耐药位点为A181V/T 、N236T 等。

2. HBV 耐药检测常见方法比较Sanger 测序法：该方法被认为是检测HBV 基因型变异的金标准，能够检测已知和未知的变异位点，但是该方法只能定性不能定量，且操作程序较复杂，对病毒突变检测的灵敏度不高，仅能检测出20-30%以上的突变株。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术：适于已知短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger 测序法相媲美，而速度却大大的提高，还具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(single nucle—otide potymorphisms，SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，操作非常简便。

其具有以下优点：不需要制胶，不需要毛细管，也不需要荧光染料和同位素，序列分析简单，结果准确可靠，在临床检测应用上有优势。

参考文献：[1] Lee CZ，Lee HS，Huang GT，Yang PM，Sheu JC．Detection of YMDD mutationusing mutant—specific primers in chronic hepatitisB patients before and after larnivudine treatment．World J Gastroenter01．2006，12(33)：5301—5305．[2] Chang TT,Lai CL．Hepatitis B Virus with Primary Resistance to Adefovir．N Engl J Med．2006，355(3)：322·323．[3] Schildgen O，Sirma H，Funk A，Olotu C，Wend UC，Hartmann H，Helm M，Rockstroh JK,Willems WR Will H，Gerlich WH．Variant of hepmifis B virus with primaryresistance to adefovir．N Engl J Med．2006，354(1 7)：1 807-1 8 12．[4] Warner N，Locamini S．The antiviral drug selected hepatitis B vires rtAl 8 1 T/sW172*mutant has adominant negmive secretion defect and alters the typical profile of viral rebound．Hepatology，2008，48：88一98．[5] Lai MW，Yeh CT．The oncogenic potential of hepatitis B virus rtA 1 8 1 T/surface truncation mutant．Antivir Ther，2008，1 3：875—879．[6] Dahari H，Shudo E，Ribeiro RM，et a1．Modeling corn plex decay profiles ofhepatitis Bvirus during antiviral therapy．Hepatology，2009，49：32-3 8．[7] Liaw YF，Sung JJ，Chow WC，et a1．1amivudine for patients with chronichepatitis B and advanced l iver disease．N Engl Med，2004，351(15)：1521—1531．。

乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测一．检验项目：乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测二．检验目的：在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测，能够：1). 区分中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型；2). 检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型；3). 对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HBV流行病学研究。

三．临床意义：HBV基因型分为9种（A-I），其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型，C型高于D型。

与C型患者相比，B型患者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌。

核苷（酸）类似物，如拉米夫定（Lamivudine，LMV），替比夫定（Telbivudine,LdT），阿德福韦酯（Adefovir,ADV）和恩替卡韦（Enticavir,ETV）等是抗HBV常见药物。

但这些药物都无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。

HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。

乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。

四．标本送检要求：4ml黄色帽血清管，空腹采集后立即送检，室温放置不宜超过2小时，如不能立即送检可于4℃保存一周，如需长期保存请放入－20℃冻存，运输过程中请注意保持低温。

五．开单名称：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定或进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“实验室”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定六．收费：570元/例七．送检时间：周一至周日8：00am－12：00am八．送检地点：检验科三楼服务台九．报告时间：抽血后，7个工作日后进入我院计算机检查报告系统，查看检测结果。

二、HBV基因变异主要的检测方法对于核苷酸类似物耐药的检测，欧美国家多采用IN—NO—LIPA方法，其灵敏度和特异性都比较高，但试剂盒非常昂贵，在我国尚难推广普及。

目前国内检测HBV基因耐药变异的方法主要有以下几种，各有其优缺点。

下面将逐一阐述。

（一）聚合酶链反应一逆向点杂交（PCR—RBD）技术利用PCR—RBD技术可实现一次检出10余种至几十种突变位点。

首先设计带标记的靶序列扩增引物和检测各种耐药突变位点的特异性探针，将各探针固化在尼龙膜上，制成能够检测所有耐药相关SNP突变位点和类型的检测膜条；然后用PCR对检测区域的HBVDNA片段进行扩增，并将扩增产物与检测膜条进行杂交，通过加入四甲基联苯胺进行显色，便可直接判断有无基因耐药突变和突变的类型等结果。

刘彦辰等利用该技术建立了LAM、ADV、ETV3种NA药物相关的10个耐药位点上的突变检测，检测结果与直接测序法一致。

（二）聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）用特异性引物PCR扩增目的DNA，再用限制性内切酶消化切割扩增产物，然后通过凝胶电泳分辨不同HBV突变类型产生的由不同片段长度构成的多态性来判断有无基因耐药变异。

该方法较简便，具有一定的敏感性和特异性，可检测数量占HBV准种池5％的耐药变异株；曾被国内外众多实验室应用于LAM耐药变异的检测工作中，近来国内也建立了基于该技术的ADV耐药变异检测方法。

但所需的限制性内切酶类型较多，有些耐药突变很难找到合适的限制性内切酶。

因此，可检测的突变类型有限，对于少数耐药变异位点监测不失为一种简便、快速且廉价的方法。

但随着多种NA的相继问世和HBV耐药变异位点的不断出现，该方法将难以胜任多位点变异的检测。

（三）基因芯片（gene chip）技术亦称DNA芯片（DNA chip）或DNA微阵列（DNA microarray）技术，其基本原理与RBD技术相似，是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序和高密度地排列、固定在玻璃或膜等载体上，然后与待测有标记的样品核酸按碱基配对的原则杂交，然后检测结果。

乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程（PCR和DNA反向点杂交）1. 目的：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规章，保证检测结果的准确性。

2. 应用范围：对HBV的基因型和耐药突变基因检测。

3. 职责3.1 文件编写：实验室技术员。

3.2 文件审核：实验室主管。

3.3 文件审批：实验室主任。

3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。

4. 参考文献4.1 亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒剂说明书。

4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。

5. 内容5.1 检测方法：PCR和DNA反向点杂交5.2 实验原理：设计特异的PCR引物扩增获得HBV目的基因片段，该片段包含了所要检测的基因型和耐药基因突变位点。

通过PCR产物与设计的探针进行特异性杂交，根据膜条特定位置显色（蓝色）与否来判断HBV的基因型和耐药突变类型。

5.3 性能参数3 copies /ml 。

5.3.1 灵敏度：检测下限为 1.0 ×105.3.2 稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。

5.4.1 标本类型：血清或血浆。

5.4.2 标本保存：制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，2～8℃保存不超过48h，-18 ℃以下保存不超过半年，应避免反复冻融。

5.4.3 运送条件：冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时不宜超过48h。

5.5 设备和试剂5.5.1 设备：DA 7600 荧光定量PCR仪、低速离心机、生物安全柜、高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/ 干式恒温器、冰箱（4℃、-20 ℃）、移动/ 固定紫外灯、三孔电热恒温水浴箱、振荡恒温水浴箱。

5.5.2 试剂：5.5.2.1 试剂品牌亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒。

5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3401179号。

乙肝病毒基因分型、耐药突变基因检测与临床摘要】目的:通过对地区慢性乙型肝炎患者HBV病毒基因分型、耐药突变基因的检测，明确其基因型，确认患者是否耐药，从而指导临床抗病毒治疗。

方法:采用荧光定量PCR和基因芯片反向斑点杂交技术检测102例慢性乙型肝炎患者血清HBV基因型和耐药突变基因型。

结果:102例慢性乙型肝炎患者中（1）血清HBVDNA定量为（4.5±2.3）×103～（5.8±1.5）×108copies/ml（2）HBV基因型C型77例占77.5％，B型24例占23.5％，D型1例约占1％（3）其中79例未采取过核苷（酸）类药物抗病毒治疗的患者未出现耐药，23例使用过核苷（酸）类药物抗病毒治疗一个疗程以上的，耐药突变点变异为M204V/I型的13例，L180M 型的为5例，L180M+M204VI的为5例，未检出其他突变基因型。

23例耐药基因型中HBV-C基因型占20例，3例为HBV-B基因型。

结论:本地区HBV基因型以C型为主，核苷（酸）类药物抗病毒治疗过程中HBV-C基因型容易发生基因突变而耐药，且以M204V/I突变型为主。

检测HBV基因型和耐药突变型是指导临床抗病毒治疗的重要指标。

【关键词】HBVDNA HBV基因型耐药基因【中图分类号】R512.6+1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）18-0208-021.资料与方法1.1 一般资料病例选择2011年6月－2013年6月在本院检测的102例血清HBSAG（+）,HBVDNA定量为（4.5±2.3）×103～（5.8±1.5）×108copies/ml的慢性乙型肝炎患者，慢性乙型肝炎的诊断依照《病毒性肝炎诊断标准》[1]。

其中男性为74例，女性为29例，年龄为18～59周岁。

留取血清标本作基因分型，耐药突变基因检测。

（102例慢性乙型肝炎患者中23例采取过核苷（酸）类药物抗病毒治疗一个疗程以上）1.2 方法1.2.1 标本采集采集慢性乙型肝炎患者空腹不抗凝静脉血3ml,3000r/min离心10min分离出血清检测。

拉米夫定致ＨＢＶ基因耐药检测方法及临床进展拉米夫定等核苷（酸）类似物长期治疗最重要的问题是基因突变导致耐药的产生。

现就拉米夫定基因耐药检测方法及临床进展作一综述。

1 基因耐药检测方法基因耐药是指乙肝病毒基因发生特定的突变，并在体外实验中证实与耐药有直接关系。

HBV复制过程中一个显著特点是以RNA为中间体进行逆转录，这一个过程因其DNA多聚酶缺乏校对功能而易发生变异，其变异发生率比一般DNA 病毒大约10，000倍，各种类型变异均可发生，各编码区亦均可发生变异，P区编码HBV DNA聚合酶，为拉米夫定作用靶点，其突变导致耐药的发生。

常用的检测方法如下。

1.1 核苷酸序列测定：将PCR扩增与核酸序列分析技术结合，直接测定HBV DNA聚合酶基因序列，可以检测出多位点的变异，称为PCR-序列分析，简称直接测序。

是分析病毒基因的金标准，其主要优点是可检测出新的变异株，这对服用过抗病毒药物治疗的患者检测出未知的耐药突变株特别重要。

其不足之处在于很难检测突变株与野生株混合感染（突变病毒占30%仍较难检测）[1]。

另外操作费时，费力，检测成本高，及检测结果分析技术难度较大等限制了其在大规模标本临床检测中的应用。

现代DNA测序大都应用循环测序的技术，采用新型的超纯热稳定多聚酶，快速结合核苷酸，其方法简单易行，大大提高了测序的自动化程度，有望弥补既往测序方法的不足。

1.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）：限制性片段长度多态性（RFLP）技术的原理是PCR扩增目的DNA，扩增产物在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段，继之在电泳上形成不同长度的DNA片段条带。

因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可用此方法检测。

其灵敏度和特异性好，且可以用于混合感染的检测。

另外实验简单、快速，无需特殊仪器等特点，使之在大规模临床检验中应用广泛。

乙型肝炎病毒耐药突变基因的检测与分析姜清明【摘要】目的检测该院2013年-2015年乙型肝炎患者基因分布及病毒耐药基因突变情况及相关性和临床意义.方法采用荧光定量和基因芯片技术检测240例乙型肝炎患者乙肝病毒(HBV)基因型和对拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定药物突变基因型.结果 240例乙型肝炎患者中,HBV基因型包括:B型61.3％(147/240)、C型25.0％(60/240)、B和C混合型5.4％ (13/240)、其他型8.3％(20/240),未检出D型.182例未出现耐药,拉米夫定耐药突变44例,阿德福韦出现耐药突变者7例,恩替卡韦出现耐药突变者6例,替比夫定出现耐药突变者为1例.M204V以及M204I是两种常见的拉米夫定耐药突变情况,在阿德福韦耐药突变中以N236T±A181位碱基替换相对常见;T184位碱基替换是恩替卡韦耐药突变的典型代表;M204I是替比夫定耐药突变的主要表现.部分从来没有采用核苷酸等药物治疗者也有可能被检测出耐药突变情况.44例出现拉米夫定耐药的基因型中,180M 及其混合突变型占86.4％(38/44),C型HBV基因突变占61.4％(27/44),且主要为180M耐药突变型(24/27).结论检测乙型肝炎病毒耐药突变基因,可以帮助医学工作者确定患者是否存在耐药性,从而选择恰当的抗病毒方法对其进行治疗.【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2017(025)002【总页数】3页(P84-86)【关键词】肝炎病毒;乙型;耐药;突变基因【作者】姜清明【作者单位】广东省粤北第二人民医院检验科,广东韶关512231【正文语种】中文【中图分类】R512.62乙型肝炎简称乙肝，作为全球性关注的公共卫生问题，严重威胁到人类健康，据报道，慢性乙型肝炎病毒携带者全球多达3.6亿人，在中国，乙肝病毒携带者占三分之一。

乙型肝炎可成为肝硬化、肝癌和肝衰竭的诱因，严重者甚至可引发死亡。