分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展(精)
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结核杆菌对利福平药物的敏感性试验(一)(精)
结核杆菌对利福平药物的敏感性试验(一)【摘要】目的分析结核分枝杆菌对利福平的耐药现况，为结核病的防治提供依据。
方法采用直接涂片检查法和培养法,对肺结核病人的痰液进行检查，阳性标本经抗酸染色镜检确认后，采用绝对浓度法的间接法进行耐药性测定。
结果 131例疑似肺结核病人痰标本中，直接涂片法检出阳性标本21例，阳性检出率为16.0%（21/131）；培养法共检出阳性标本56例，阳性检出率为42.7%（56/131）。
比较两种检测方法的阳性检出率，差异有显著性（P0.05）。
培养法高于直接涂片法。
将培养阳性标本进行利福平药物敏感性试验，其中有17株发生耐药，耐药率为30.4%（17/56）。
结论结核杆菌对利福平的初始耐药率仍处在较高水平，必须进一步加强对耐药结核杆菌的监控。
【关键词】结核分枝杆菌福平药敏试验Study on the primary drug resistance against rifampicin for tubercolusisZHANG Sheng, CHEN Si dong, WANG Bao guo，ZHOU Yong,ZHOUWei ping(Institute of Disease Prevent and Control of SonggangTown,Shenzhen 518105; Guangdong College ofPharmacy,Guangzhou,Guangdong 510006,China)Abstract:Objective To study the situation and trend of rifampicin resistance for tuberculosis and provide the basis for tuberculosis prevention and treatment. Methods Sputum fluid is examined withdirect smear and culture on modified Lowenstein-Jensen medium after treatment with 4% NaOH. Then the positive samples were subjected to susceptibility testing against rifampicin using absolute concentration method. Results The positive rate with culturing and smearing method was 42.7%（56/131）,and the positive rate with direct smearing method was16.0%（21/131）. The preva lence rate of primary drug resistance was 30.4%(17/56). Conclusion The rate of primary drug against rifampicin is still at a higher level. Monitoring of the resistance of tuberculosis should be strengthened.Key words: mycobacterium tuberculosis; rifampicin; drug resistance test结核病是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题,世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一。
分子生物学技术在结核病诊断及耐药检测中的应用
分子生物学技术在结核病诊断及耐药检测中的应用发表时间：2018-10-15T14:00:23.437Z 来源：《医药前沿》2018年9月第26期作者：宫俐韩中波[导读] 亟需引进新的实验室技术辅助结核病、耐药结核病的诊断。
（吉林市结核病防治研究所吉林吉林 132011）【摘要】结核病是我国重点防治的重大传染性疾病。
目前耐药结核病、流动人口和HIV/TB双重感染已经成为结核病防控所面临的难题，其中结核杆菌耐药性是我国结核病防控中起着非常重要作用的因素。
结核病、耐药结核病的实验室诊断技术相对滞后。
亟需引进新的实验室技术辅助结核病、耐药结核病的诊断。
【关键词】分子生物学；结核病；应用【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）26-0069-02Xpert Mtb/RIF技术使用半定量巢氏荧光PCR，该技术针对结核杆菌利福平耐药基因rpoB基因区设定引物、探针，扩增荧光检测，其是否发生基因突变，检测标本中是否含有结核杆菌及是否对利福平耐药，整个实验过程需3小时左右。
线性探针杂交技术（Hain）检测技术直接从临床收集的病人肺部涂片阳性痰标本中提取核酸DNA、用生物素标记的引物进行多重PCR扩增和反向杂交。
通过检测rpoB基因突变（编码RNA聚合酶β-亚单位）确定对利福平的耐药性；通过检测katG基因（编码过氧化氢酶）和inhA基因的启动子区（编码NADH烯酰酸性磷酸酶还原酶）确定对异烟肼的耐药性。
从而，对来自培养物或病人肺部涂片阳性痰标本的结核分枝杆菌复合群及其耐利福平和/或异烟肼耐药基因进行分子生物学检测。
1.资料和方法1.1 标本来源2015年10月至2018年6月期间吉林市结核病防治研究所及所辖各县区结防所收治的疑似结核病患者共1345份痰标本。
1.2 检测方法对1345份痰标本进行荧光染色涂片镜检检测、结核分枝杆菌培养、结核杆菌比例法药敏，相关操作及结果判定。
利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究
利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究作者：赵梁来源：《中国实用医药》2019年第32期【摘要】目的分析利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题。
方法 130株结核分枝杆菌株，其中20株结核分枝杆菌株对于乙胺丁醇、异烟肼、利福平和链霉素敏感， 2株H37Rv结核杆菌株，;64株对于剂量为250 μg/ml利福平表现出耐药（R250）， 44株对于剂量为50μg/ml利福平表现出耐药（R50），均开展DNA序列分析。
结果在108株耐利福平结核分枝杆菌中，发生rpoB基因突变92株（85.2%），250 μg/ml利福平表现出耐药（R250）耐利福平结核分枝杆菌基因突变率78.1%明显低于50 μg/ml利福平表现出耐药（R50）耐利福平结核分枝杆菌的95.5%，差异具有统计学意义（P<0.05）。
R250耐利福平结核分枝杆菌基因位置主要以531密码子为主，突变率为58.0%（29/50）;基因位置在511密码子突变率为16.0%（8/50）。
R50耐利福平结核分枝杆菌基因突变位置主要以533密码子为主，突变率为23.9%（11/42）;其次基因位置在531、562密码子，突变率均为19.0%（8/42）。
结论绝大部分对于利福平耐药的结核分枝杆菌均存在rpoB基因突变现象，而对于利福平高耐药结核分枝杆菌的rpoB基因之中，主要突变特征为531位密码子突变和多个密码子联合突变。
其对于利福平低耐药结核分枝杆菌的rpoB基因内突变位置呈现出了散在性分布现象。
【关键词】利福平;耐药结核分枝杆菌;rpoB基因;基因突变DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2019.32.108当前在治疗结核疾病过程中，结核分枝杆菌（MTB）高耐药性问题已然成为了最近几年结核疾病控制中的重要难题，其也为结核病恶化的主要因素[1]。
利福平为一类快速杀菌剂，能够明显缩短结合疾病的治疗疗程，其在短程化疗中起到了相当重要的作用。
Xpert MTB／RIF在利福平耐药检测中的价值
Xpert MTB／RIF在利福平耐药检测中的价值吴芳妮(综述);黎友伦(审校)【期刊名称】《临床肺科杂志》【年(卷),期】2016(021)009【总页数】4页(P1700-1703)【作者】吴芳妮(综述);黎友伦(审校)【作者单位】400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院;400016 重庆，重庆医科大学附属第一医院【正文语种】中文结核病是威胁人类健康的高发传染病，据WHO估计在2014年全球有960万人感染结核分枝菌株(mycobacterium tuberculosis，MTB)，有150万人死于结核病[1]。
而近年随着一些免疫疾病的增多和HIV感染的蔓延，结核的发病率呈上升趋势，其中耐药结核病疫情的出现更是对结核病控制造成了极大困扰[2]，最新的全国结核病耐药性基线调查[3]显示，涂片阳性的肺结核患中耐多药结核 (multiple drugs resistance-tuberculosis，MDR-TB)率和超级耐药结核(extensively drugs resistance-tuberculosis，XDR-TB)率分别为 10.2%和0.7%。
而利福平作为一线抗结核药，其耐药发生率更是逐年递增，并常因利福平的耐药而导致抗结核治疗的失败。
近年来，随着MTB耐药分子机制的阐明，涌现出许多基于分子生物学的药敏检测新方法，新研发的利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)就是其中之一，本文就Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的原理、敏感性与特异性、假阳性及假阴性、实效性、安全性及应用成本等方面作一综述。
随着对MTB全基因组的阐明，已经相继发现了几个主要与耐药相关的基因突变，最新的研究[4-5]显示95%利福平耐药的MTB株包含MTB菌体RNA聚合酶β亚基的活性位点编码区rpoB 基因，并且在rpoB基因81bp利福平耐药决定区域(rifampin resistance-determining region，RRDR)存在基因突变，相反，利福平敏感菌株在此区域极少发生基因突变。
利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究
利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究1. 引言1.1 引言背景利福平是一种强大的抗结核药物，其能够有效地抑制结核分枝杆菌的生长和繁殖。
随着抗生素的广泛使用，耐药性的问题也日益突出，使得利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的有效性受到影响。
研究利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题，对于指导临床实践具有重要意义。
本研究旨在系统性地探讨利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的药理作用、应用效果以及存在的问题，并提出解决方案，为临床治疗提供理论依据。
通过本研究的开展，有望为未来研究方向提供参考，推动耐药结核分枝杆菌治疗领域的进步和发展。
1.2 研究目的研究目的是通过对利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题进行深入探讨，了解其药理及耐药机制，探讨其在临床应用中存在的问题以及可能的解决方案，从而为提高耐药结核治疗效果提供理论支持和临床指导。
此研究旨在全面了解利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的作用机制和疗效，从而为进一步优化治疗方案、提高治疗效果和减少药物耐药性提供科学依据。
通过对利福平在临床应用中存在的问题进行分析和探讨，为临床医生在治疗实践中遇到的困难提供参考，并为未来的研究方向提供思路和建议。
通过本研究的深入开展，希望可以更好地理解利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的作用机制和影响因素，为临床实践提供更为全面和准确的参考依据，从而提高治疗效果，减少患者痛苦，降低耐药性发生的风险。
1.3 研究意义耐药结核分枝杆菌是一种令人头疼的疾病，治疗耐药结核分枝杆菌的难度较大。
过去几十年，结核分枝杆菌对抗结核药物的耐药性越来越高，给临床治疗带来了极大挑战。
利福平作为重要的抗结核药物，被广泛应用于耐药结核分枝杆菌的治疗中。
对利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的应用及效果进行深入研究具有重要的意义。
研究利福平的药理及耐药机制可以帮助我们更好地了解这种药物对耐药结核分枝杆菌的作用机制，为临床治疗提供理论依据。
探讨利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的应用，可以帮助医生选择更合适的治疗方案，提高治疗效果。
利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究
利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题研究【摘要】本文旨在研究利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的问题。
首先介绍了研究的背景，包括耐药结核分枝杆菌对公共健康造成的威胁。
接着详细描述了研究方法，包括利福平的使用方案和实验设计。
实验结果显示利福平在治疗耐药结核分枝杆菌中的有效性和副作用。
在讨论部分探讨了利福平的优势和局限性，并提出了未来研究的方向。
结论部分总结了利福平在耐药结核分枝杆菌治疗中的重要性和局限性，强调了其在防治耐药结核分枝杆菌中的潜在作用。
通过本研究，可以为临床治疗提供重要参考。
【关键词】利福平、耐药结核分枝杆菌、治疗、研究、背景、方法、结果、讨论、结论。
1. 引言1.1 引言耐药结核分枝杆菌（MDR-TB）是一种对常规抗结核药物产生耐药的结核病菌株，治疗困难且耗时较长。
目前，世界卫生组织数据显示，全球约有48万人感染MDR-TB，其中约有25%的患者最终因此病而死亡。
寻找新的治疗方法和药物对于解决MDR-TB问题至关重要。
利福平是一种常用于治疗结核病的药物，对结核杆菌具有很强的杀灭作用。
利福平在MDR-TB患者中的疗效却并不尽如人意，部分患者表现出对利福平的耐药性。
对于这一现象，我们需要深入研究其原因，并找到解决方法。
本研究旨在探讨利福平在MDR-TB治疗中出现的问题，并试图找出可能的解决方案，以提高MDR-TB患者的治疗效果和生存率。
通过对研究背景、研究方法、实验结果和讨论进行全面分析，我们希望能为MDR-TB治疗领域的进展做出贡献。
2. 正文2.1 研究背景耐药结核分枝杆菌是一种对传统抗结核药物产生耐药性的病原体，已经成为全球公共卫生的严重问题。
据世界卫生组织统计，每年有超过1000万人感染结核病菌，其中大约5%至10%患者是耐药菌株。
耐药结核分枝杆菌对目前使用的抗结核药物表现出高度耐药性，且治疗难度大大增加，导致治疗成功率明显下降。
当前的结核病治疗方案主要依赖于药物联合治疗，然而对于耐药结核分枝杆菌的治疗，常规药物已经无法取得理想的疗效。
利福平药物的研究进展
利福平药物的研究进展（石家庄学院化工学院，河北石家庄050035）摘要：利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性，在临床上主要用来作为肺结核病的治疗药物。
本文主要介绍了利福平药物的研究进展。
关键词：利福平;结核分枝杆菌;利福霉素利福平（rifampicin,RIF）为利福霉素类半合成抗生素衍生物，是目前治疗结核病最有效的药物之一。
该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（包括麻风分枝杆菌等）在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。
利福平与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成，防止该酶与DNA连接，从而阻断RNA转录过程，使DNA和蛋白的合成停止。
1、利福平的发现过程利福平发明于1965年，利福平的发现使结核病的治疗又发生了一次更大的飞跃, 有的专家对利福平的抗结核作用评价非常高，认为现在抗痨治疗已进入利福平时代，并认为过去要手术治疗的结核病，有了利福平完全可以不需手术而把病情控制下来。
我们在实际工作中，已证明利福平是一种很好的抗痨药。
2、利福平的理化性质利福平(Rifampicin ,RFP) 分子式：C43H58N4O12 (M=822.95),化学名称为 3-[[(4-甲基-1-哌嗪基）亚氨基]甲基]-利福霉素。
本品为鲜红色或暗红色的结晶性粉末，无臭、无味，在氯仿中易溶，在甲醇中溶解{2}.利福平为脂溶性药物，在水中的溶解度很小（0.027%）[4]RFP的结构式如下：利福平的紫外吸收特征：取干燥至恒重的RFP适量，加甲醇制成一定浓度的溶液，以甲醇作空白，于200~600nm 的波长范围内进行紫外光谱扫描，结果如下图【3】：3、利福平的药理及药效利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性。
该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（包括麻风分枝杆菌等）在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。
利福平对需氧革兰阳性菌具良好抗菌作用，包括葡萄球菌产酶株及甲氧西林耐药株、肺炎链球菌、其他链球菌属、肠球菌属、李斯特菌属、炭疽杆菌、产气荚膜杆菌、白喉杆菌、厌氧球菌等。
结核病分子生物学检测技术研究进展
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基于上述研究 在检测涂片阳性肺结核 显示 和 B-J*++/
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耐药结核分枝杆菌的分子流行病学研究及耐药相关基因的分子生物学快速检测
图２异烟肼耐药表型的分布㈥３利福平耐药表型的分布（－－）、我国耐药结核分枝杆菌耐药相关基因谱１．ＰＣＲ．ＲＦＬＰ检测结果１）菌株ＤＮＡ的抽提与鉴定通过ｋａｔＧ２１０ｂｐ基因片段的扩增，对抽提的４２９株结核分枝杆菌的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ鉴定，扩增产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳，有４０７株可见单一清晰的目的条带（２１０ｂｐ，见图４），有２２株未见特异性条带。
１２３４５６Ｍ７－－－・－－－－－一７５０ｂｐ‘。
‘‘——５００ｂｐ－－－・－－——一２５０ｂｐ‘。
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‘——１００ｂｐ图４结核分枝杆菌基因组ＤＮＡ的鉴定：Ｍ为ＤＮＡ分子量（ＤＬ２０００），１－６为临床分离株提取的基因组ＤＮＡ为模板扩增的阳性ｋａｔＧ基因目的片段，７为阴性对照。
２）ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法检测ｋａｔＧ基因３１５位点突变结果（见图５）ｋａｔＧ基因扩增阳性的４０７株菌株用于进行ＭｓｐＩ限制性内切酶的酶切消化及ＰＡＧＥ电泳。
如图５所示菌株２—３及５—９泳道中ＫａｔＧ基因被消化成三个片段（７９ｈｐ，５３ｂｐ，６６ｂｐ），为野生型。
１及４泳道的菌株ＤＮＡ在酶切消化后６６ｂｐ片段被一个更小的４８ｂｐ片段所代替，为Ｓ３１５Ｔ突变型。
３）ＲＦＬＰ方法检测ｋａｔＧ基因３１５位突变菌株的耐药谱在ｋａｔＧ基因ＰＣＲ扩增阳性的４０７株菌株中，有ＩＮＨ敏感株１９１株，均未发现３１５位突变。
ＩＮＨ耐药株２１６株，采用ＰＣＲ．ＲＦＬＰ方法发现６５｜３％（１４１／２１６）耐药株存在￥３１５Ｔ突变。
７９ｂｐ—－－－－－一５３ｂｐ．．，．．一４８ｂｐ‘。
’。
一一１１０ｂｐ－－－－－－－－一ｆｉ？ｂｐ一３４ｂｎ图５ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法检测结核分枝杆菌ｋａｔＧ基因３１５位点突变的ＰＡＧＥ电泳图谱：Ｍ．为ＤＮＡ分子量（ｐＵＣ１９ＤＮＡ／Ｍｓｐｌ（ＨｐａｉｄＭａｒｋｅｒ２３），１，４泳道为突变型菌株，２－３及５－８为野生型菌株。
２．ｋａｔＧ基因缺失的检测将以上２２株未见到有特异性条带扩增的菌株基因组ＤＮＡ用另一对引物进行ＰＣＲ反应扩增，结果其中有６株可以见到有单一清晰的目的条带（２７００ｂｐ），另外１４株仍然未见到特异性条带的扩增。
GeneXpert结核分枝杆菌利福平技术在结核病早期诊断中的应用及对利福平耐药研究
参考文献 ［1］ 朱阵，李冰，周绪正，等．环境中细菌抗药性的研究进展［J］．中
国畜牧兽医，2016，43（12）：3368-3374. ［2］ Andrews RE，Johnson WS，Guard AR，et al． Survival of entero-
cocci and Tn916-like conjugative transposons in soil ［J］． Can J Microbiol，2004，50（11）：957-966． ［3］ Fang H，Wang H，Cai L，et al． Prevalence of antibiotic resistance
中国药物与临床 2019 年 3 月第 19 卷第 5 期 Chinese Remedies & Clinics，March 2019,Vol.19,No.5
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项目
例数
食品分离株耐药率 66 临床分离株耐药率 142
χ2 值 P值
表 1 金黄色葡萄球菌食品分离株和临床分离株对抗菌药物的耐药率比较
20181015表1金黄色葡萄球菌食品分离株和临床分离株对抗菌药物的耐药率比较项目例数青霉素头孢唑林头孢曲松阿莫西林克拉维酸红霉素克林霉素庆大霉素例数例数例数例数例数例数例数食品分离株耐药率666090969111167345548184060620303临床分离株耐药率14213695834239382684632412084598690584082值19626399254914272137194050238p值0202001301180000068802700167项目例数左氧氟沙星四环素利福平复方新诺明替考拉宁利奈唑胺万古霉素例数例数例数例数例数例数例数食品分离株耐药率6669191369136691000000临床分离株耐药率142362545135927190372610000002值73931089609107908p值0006000104320005831中国药物与临床2019年3月第19卷第5期chineseremediesclinicsmarch2019vol19no5表1xpertmtbrif检测与改良罗氏固体培养法比较项目改良罗氏固体培养法阳性阴性合计xpertmtbrif阳性12916145xpertmtbrif阴性13142155合计142158300表2xpertmtbrif检测与痰涂片染色法比较项目痰涂片染色法阳性阴性合计xpertmtbrif阳性1450145xpertmtbrif阴性19136155合计164136300表3xpertmtbrif与比例法检测利福平耐药性分析项目比例法药敏试验耐药敏感合计xpertmtbrif耐药516xpertmtbrif敏感13233合计6333912方法
国畜牧兽医，2016，43（12）：3368-3374. ［2］ Andrews RE，Johnson WS，Guard AR，et al． Survival of entero-
cocci and Tn916-like conjugative transposons in soil ［J］． Can J Microbiol，2004，50（11）：957-966． ［3］ Fang H，Wang H，Cai L，et al． Prevalence of antibiotic resistance
中国药物与临床 2019 年 3 月第 19 卷第 5 期 Chinese Remedies & Clinics，March 2019,Vol.19,No.5
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项目
例数
食品分离株耐药率 66 临床分离株耐药率 142
χ2 值 P值
表 1 金黄色葡萄球菌食品分离株和临床分离株对抗菌药物的耐药率比较
20181015表1金黄色葡萄球菌食品分离株和临床分离株对抗菌药物的耐药率比较项目例数青霉素头孢唑林头孢曲松阿莫西林克拉维酸红霉素克林霉素庆大霉素例数例数例数例数例数例数例数食品分离株耐药率666090969111167345548184060620303临床分离株耐药率14213695834239382684632412084598690584082值19626399254914272137194050238p值0202001301180000068802700167项目例数左氧氟沙星四环素利福平复方新诺明替考拉宁利奈唑胺万古霉素例数例数例数例数例数例数例数食品分离株耐药率6669191369136691000000临床分离株耐药率142362545135927190372610000002值73931089609107908p值0006000104320005831中国药物与临床2019年3月第19卷第5期chineseremediesclinicsmarch2019vol19no5表1xpertmtbrif检测与改良罗氏固体培养法比较项目改良罗氏固体培养法阳性阴性合计xpertmtbrif阳性12916145xpertmtbrif阴性13142155合计142158300表2xpertmtbrif检测与痰涂片染色法比较项目痰涂片染色法阳性阴性合计xpertmtbrif阳性1450145xpertmtbrif阴性19136155合计164136300表3xpertmtbrif与比例法检测利福平耐药性分析项目比例法药敏试验耐药敏感合计xpertmtbrif耐药516xpertmtbrif敏感13233合计6333912方法
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分子生物学方法检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展摘要: 近年对结核杆菌耐药机制的研究表明，rpoB基因是利福平耐药相关基因，耐药株通常发生特定位点基因突变，因此可以通过鉴定突变有无而评估其利福平耐药性，本文对这方面研究做一简要综述。
结核病至今仍是世界上一个严重的公共卫生问题，估计目前全世界每年有800万新病例发生，290万人死于结核病，是当今单一致病菌致死的最主要死因。
近十几年来结核病疫情呈现全球性明显回升趋势，产生原因之一是耐药菌株的产生和播散。
1990年我国结核病流行调查结果表明，我国临床分离株耐药率达39.9％，初始耐药率31.7％，复治继发耐药率47.8％。
利福平是一种主要的抗结核药物，对利福平耐药常常导致化疗失败，且被认为是多耐药菌株的标志之一。
因此早期迅速对结核患者利福平耐药性进行鉴定十分重要。
现将有关研究进展做进一简要综述。
传统方法依靠直接或间接含药培养进行结核分支杆菌利福平耐药性鉴定，这是体外结核杆菌耐药性的直接证据，并且可以了解其对利福平耐药程度。
但各实验室间所用培养基不同，检测方法不同，结果判定标准不一，导致结果报告差异，并且由于结核分支杆菌本身属于缓慢生长菌，使得耐药培养耗时长，通常需8～12周，不能满足现代短程化疗需要。
近年发展起来的应用BACTEC460TB系统进行结核杆菌快速培养及药敏测定可以大大缩短结果回报时间，但此法建立在培养方法基础上仍需数天出结果，加之仪器试剂昂贵，有放射性污染等，限制了临床广泛应用。
1 利福平耐药基因的研究关于结核杆菌利福平耐药机制一直存在三种假设，膜通透性改变、耐药质粒介导及染色体组基因突变（耐药性有关基因），其中已证实耐药基因突变与利福平耐药有密切关系。
对于细菌利福平耐药基因研究首先在大肠杆菌取得重要突破。
首先发现利福平耐药的大肠杆菌其RNA聚合酶有突变并且只发生在β亚单位上，并推知产生这种β亚单位突变的基因位点相接，进一步对基因研究获得了大肠杆菌野生株编码RNA聚合酶β亚单位基因（rpoB）序列，并发现耐利福平的大肠杆菌有rpoB基因突变。
由于编码RNA聚合酶基因在细菌进化中呈高度序列保守性，根据对大肠杆菌利福平耐药基因的研究资料，Telenti[1]首先对结核分支杆菌利福平耐药基因突变进行了全面研究，发现在与大肠杆菌rpoB基因突变高发区（Ⅰ区）相应位点（511～533aa）的长69bp片段内，64/66耐药株有突变发生，而未见于56株利福平敏感结核菌株。
此后许多研究都证实这一结果，并发现发生于此区城内新的突变位点[2～5]。
而Miller[6]做了这样一项研究，他应用致点突变技术造成编码rpoB基因531号氨基酸（参考大肠杆菌基因位点）碱基突变并将其导入利福平敏感的耻垢分支杆菌株LRZZZ中，使之发生了表型改变，即由原来的利福平敏感株转为利福平耐药，也证实rpoB基因突变是导致利福平耐药的唯一原因。
Williams[4]对一患者感染的结核杆菌株发生利福平耐药表型转换前后做了rpoB基因序列分析研究，证实表型发生改变后其耐药基因发生了改变。
但ropB基因突变致利福平耐药详细机制目前还未十分明了。
2 分子生物学检测方法上述对结核杆菌利福平耐药机制研究取得的重要成果为运用分子生物学方法进行耐药性评估提供了坚实的理论依据，其技术路线基本上是在用PCR方法对rpoB基因突变集中区域扩增基础上，对扩增产物进行突变鉴定，归纳如下：2.1 直接顺序法对突变高发区城序列分析是鉴定突变的最直观可靠的方法，可以准确判定突变的有无及突变性质，也是其它快速间接鉴别方法的金标准。
应用放射性同位素或荧光标记测序法，已发现许多突变位点及不同的氨基酸置换。
突变在511-533这一区域内发生率达95％以上，其中以531，526，533，516四个位点最为常见[1～5]。
Williams研究了流行病学特征和结核杆菌利福平耐药突变性质之间的内在联系，认为突变位点及性质与耐药模式及程度，IS6110图谱及地位来源等无明显相关关系。
但Taniguechi[5]有不同意见，他研究结果表明513，526，531位点的突变导致对利福平高度耐药而其他位点则明显低度耐药或根本无耐药性。
总之直接测序可以得到突变详细资料，还可以对新发现突变进行鉴定，不足之处是仪器试剂昂贵，操作复杂，成本高，有放射性污染，不适于普遍推广应用。
2.2 多聚酶链式反应-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）其原理为根据在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DNA片段泳动距离的改变判定单个碱基变异。
由于利福平耐药突变只在特定区域内发生，而通过PCR方法扩增这段基因，直接电泳判定突变有无，大大简化了突变分析操作。
Telenti[1]最先评估了放射性同位素标记PCR-SSCP方法的结核杆菌rpoB突变中的应用价值。
所有利福平耐药菌株均成功地被检测出来，证明此方法特异准确。
它可以同时进行大量临床标本筛选，使结果回报时间缩至48～72小时。
目前国内外本方法的研究较多，并已有成功用于临床痰标本及脑脊液标本检测的报道[2,7,8]。
SSCP方法为临床快速简便鉴定结核杆菌ropB基因突变开辟了新领域，尽管存在一定不足，如每次电泳均需有标准结核杆菌株对照及有时差异不易区分、不能鉴别沉默突变[9]等，但仍不失为一种有广泛应用前景的方法。
2.3 双脱氧指纹图法（dideoxy fingerprinting, ddF）在对PCR产和的进行ropB基因突变检测方法的研究中，Felmee应用了ddF法[9]，这种方法结合运用了双脱氧末端终止法及SSCP法的原理，它将ropB基因片段复制产物做模板直接加入用于产生类似DNA测序产物的有放射性标记的不同长度的双脱氧末端片段，再行SSCP，经放射自显影后得出针对不同突变的特异的ddF。
这样，如果有ropB基因突变，在SSCP电泳中不仅可以从因单链构象改变产生的泳动距离差异在SSCP中得以鉴别，同时由于其双脱氧末端终止位点不同于标准株，双脱氧末段片段数目也不同而得以区分。
Felmee检测出了有不同突变（其中包括了80％已报道的ropB突变）的所有多耐药菌株，每一突变均有特异的ddF。
在与SSCP分析法的对比研究中，认为ddF方法可以克服SSCP结果受电泳条件、电泳时间影响大，受突变性质（位点及突变碱基）影响大及不能区分出，在时间和成本上都有优越性，但未见有进一步临床应用情况的报道。
2.4 异源双链形成法（heteroduplex formation, HDF） HDF可用于检测DNA单个碱基突变或缺失，原理为突变基因与无突变基因PCR扩增产物混合，变性后使其温度缓慢下降，部分可形成分别来源于突变与敏感株基因的异源双链，同时有部分形成同源双链，电泳后可将二者区分开来，并且突变不同（如单碱基突变，插入、或缺失），形成的异源双链迁移距离也不同。
Williams[4]用HDF法进行了结核杆菌利福平ropB突变检测的尝试，110株RFP 耐药株经HDF检测得到多条带形，证明有异源双链形成，而敏感株则只形成一条同源双链，HDF法与DNA测序法符合率达100％。
这种方法操作简便，判定容易，不需放射性标记，适合应用于临床，但有关报道较少。
2.5 反向系列探针杂交法（Inno line probe assay, LiPA）LiPA 方法基于探针杂交原理，先设计合成一系列探针，覆盖整个ropB突变高发区，其中S系列探针针对野毒株序列，R系列探针含数个有常见突变序列的探针，还可以设计一个有种属特异性的探针，将这一系列探针顺次固定于同一杂交膜上，在严格条件下与亲和素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，根据不同杂交带谱判定出突变有无及大致位置。
这种杂交方法可以同时进行种属鉴定，检测试剂盒已有厂家生产，结果判定容易，特异性高，易于标准化。
如Beenhouwer[10]应用此法对临床痰标本的检测中与药敏结果对照有97％（65/67）的符合率。
最近有学者[11]应用此法同时对结核分支杆菌进行种属鉴定及PCR敏感性测定，特异性达100％，对107株已知序列的结核杆菌临床分离株测定中，61株敏感株全部显示敏感型杂交带谱，203株耐药株除4株外均检测到突变带谱，误诊率下降到1.97％。
不足之处是操作复杂，成本较高。
以上分子生物学方法对结核杆菌RFP耐药性检测应用中均有快速、准确，特异等优点，可在72h内报告结果，可以满足早期临床诊治需要，是结核杆菌RFP耐药性测定发展必然趋势。
下一步研究重点是提高临床标本ropB基因扩增特异性（因其单拷贝存在于基因组中），技术条件标准化、规范化，以及将耐药性诊断及种属鉴定同时进行的方法，使其能够成为直接应用于临床的有效方法。
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