紫外吸收法测定核酸含量

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紫外吸收法测定核酸含量

思考题
1．干扰本实验的物质有哪些？ 2. 设计排除这些干扰的实验。
0.024──每毫升溶液内含1μ gRNA的A值；
1mL待测样品液中核酸（微克）
核酸％＝
1mL待测样品液中制品的毫克数
在本实验中，1项
1. 紫外分光光度计使用前要预热。
2. 比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。
3. 离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然后将转速打到最低。
4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0
二、计算公式
ΔA260
RNA浓度 =
xN
0.024 x L
式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值；
L ──比色杯的厚度，1cm；
N ——为稀释倍数；
实验十六紫外吸收法测定核酸含量
目的要求学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。
实验原理
核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。
试剂和器材
• 试剂：
• 材料
• 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取 3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。
酵母RNA干粉。
请节约使用。每八个同学用一份，即50 ml/8人

高中生物实验五、核酸定量测定

按样品各自的分析规程植被样品溶液及背景溶液 ↓
设波长，置空白，调零，置“吸光度”，读出样品吸光度 ↓
重复上步读出各标准溶液吸光度 ↓
以各样品中已知含量及读得吸光度绘制坐标图，并画出相关最佳的曲线
↓ 读未知样品的吸光度，在曲线表上找出对应浓度
标准曲线的制作表5-1
试管
1
标准DNA溶液（mL） 0
蒸馏水（mL）
5
DNA浓度(ug/ml) 0
A260
0
2 3 4 5 67 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1 4.9 4.8 4.6 4.4 4.2 4
混匀后以1号试管为空白在260nm处测定光吸收值A，以标准DNA 溶液的浓度为横坐标、A为纵坐标在坐标纸上绘制出标准曲线，
它是一条直线。
2、核酸最大紫外吸收波长（λｍ）的确定：
以上5-1表中的７号试管为测定对象，以1号试管为空白，在240～290nm范围内每隔10nm分别测定光吸收值A。注意，每次换了波长之后都需要用空白重新调校“0％T”和 “100％T”。以A 为纵坐标、λ（nm）为横坐标作一条平滑曲线，找出最高峰处所对应的波长λｍ。
3、样品测定
取一支试管，编号8，加入6mL左右待测的DNA 溶液，仍以1号试管为空白，分别在260nm和 280nm处测定其光吸收A，用A260在标准曲线上查出DNA溶液浓度C1
根据公式计算出待测DNA溶液的浓度C2 （g/mL）。
根据A260/A280的值来判断该待测的DNA样品是否纯净。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～ 50ug/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。

核酸含量测定

01
定磷试剂：含硫酸、钼酸铵、Vit.C，浅黄色，如果变绿则不能使用,每组用100mL烧杯取70mL
04
标准磷溶液：含磷量为10 μg/mL，每组用干试管取15用硫酸消化，将有机磷转化成无机磷；
02
制定定磷标准曲线；
03
测定回收率和样品总磷量。
实验步骤
1. 样品消化（每两组或三组做一份）
回收率的意义；
实验所用的水质、试剂质量、定磷试剂的酸度对测定结果的影响。
01
02
思考题
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。
将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。
将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿中。
将实验台面擦干净。
实验结束
消化管
1
2
3
RNA/mL
0
1
0
标准磷原液/mL
0
0
1
dH2O/mL
1
0
0
5mol/L H2SO4/mL
2
2
2
消煮炉中消化2—6h至溶液无色透明，冷却
dH2O/mL
1
1
1
沸水浴中加热10min（分解焦磷酸），冷却
用dH2O定容/mL
50
50
50
混匀
2. 定磷标准曲线的制定（每人做一份）每人取18支试管，按照下表平行操作：
以每管含磷量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标画标准曲线，直线应过原点。
在标准曲线上查出样品(x)和标准磷(y)的含磷量(μg)。
数据处理
计算样品总磷量：
01
计算RNA量：
02
样品RNA含量：
03
计算回收率：
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水纸擦净，溶液尽量加到试管下部，标准溶液要求用差量法。 6. 漩涡混合器的使用：用点动档，试管竖直或稍倾斜垂直向下用力。 7. 测定吸光值时，用一个比色杯装去离子水调节分光光度计零点，另一个比色杯按照从低浓度到高浓度的顺序测定，不用润洗，切忌甩比色杯，将蓝色溶液撒在仪器和地面上。

核酸含量的测定——紫外吸收法

核酸含量的测定——紫外吸收法[原理]核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。

常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。

核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。

RNA 的ε(P)260nm （）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于～。

小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （）为6 600，含磷量为%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于。

测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。

当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。

蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。

若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。

不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。

从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。

纯RNA 的A 260/ A 280≥；DNA 的A 260/ A 280≥。

当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。

RNA 和DNA 的比值分别低于和时，表示此样品不纯。

pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。

本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。

[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 DNA/RNA 样液，然后向甲管加入蒸馏水，向乙管加入过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。

3000r/min 离心10min ，各吸取上清液转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。

以蒸馏水作空白对照，使用紫外光度计分别测定上述甲乙两稀释A 260值。

核酸含量的测定——紫外吸收法

常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。

核酸的摩尔消光系数ε(P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。

RNA 的ε(P)260nm （pH7.0）为7 700～7 800，RNA 的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1μg RNA 的光吸收值相当于0.022～0.024。

小牛胸腺DNA 钠盐的ε(P) 260nm （pH7.0）为6 600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1μg DNA 钠盐的光吸收值相当于0.020。

测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。

当核酸变性降解时，其紫外吸收强度显著增加，称为增色效应。

若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。

不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。

从A 260/ A 280的比值可判断样品的纯度。

纯RNA 的A 260/ A 280≥2.0；DNA 的A 260/ A 280≥1.8。

当样品中蛋白质含量较高时，则比值下降。

RNA 和DNA 的比值分别低于2.0和1.8时，表示此样品不纯。

pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。

本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。

[方法和步骤]1、测定取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入 1.0mL DNA/RNA 样液，然后向甲管加入1.0mL 蒸馏水，向乙管加入1.0ml 过氯酸-钼酸铵沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min ，使沉淀完全。

3000r/min 离心10min ，各吸取上清液0.5mL 转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mL 。

实验九紫外分光光度法测定核酸的含量

原理：在核酸分子中，嘌呤和嘧啶碱基的共轭双键能够吸收紫外光能量，引起电子跃迁。在一定波长下，核酸溶液的吸光度与核酸浓度成正比，通过测量吸光度可以计算核酸含量。
学会使用紫外分光光度计进行核酸含量测定
操作步骤
准备标准品、未知样品和空白对照；按照仪器操作说明调整波长、设置测量模式；将标准品和未知样品分别放入样品池；记录吸光度值；根据标准品的标准曲线计算未知样品的核酸含量。
02
核酸在260nm波长处有最大吸收峰，这是核酸特有的吸收峰，可用于核酸的定量分析。
核酸的紫外吸光度与浓度的关系
随着核酸浓度的增加，吸光度也相应增加。
在一定浓度范围内，吸光度与核酸浓度呈线性关系，可以用于定量分析。
核酸含量计算公式及注意事项
核酸含量计算公式：核酸浓度（μg/mL） = (A / V) / (1000 × L) × (100 / S)
其中，A为吸光度值，V为样品体积（mL），L 为光程（cm），S为核酸分子截面积（cm²/μg）。
注意事项
实验过程中要保持光程一致，以减小误差。
实验过程中要避免样品污染，以免影响实验结果。
对于不同来源和性质的核酸样品，可能需要采用不同的实验条件和标准曲线进行定量分析。
03
实验步骤
样品制备
实验结论
根据实验结果和分析，得出实验结论，总结实验的成功与不足之处，并提出改进意见和建议。
05
实验总结
实验收获与体会
学会了使用分光光度计进行实验操作。
认识到实验操作对结果准确性的影响。
01
02
掌握了紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。
03
04
了解了核酸在紫外光下的吸收特性。

实验四、定磷法测定核酸含量(精)

实验四、定磷法测定核酸含量
1
核酸定量测定常见的方法
1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。
2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。
3. 地衣酚法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。
17
实验结束
将试管洗净，斜插在试管架上，放在台面上。
将消化管和橡皮塞洗净，放回原处。将比色杯洗净，放在实验台上的小平皿
中。将实验台面擦干净。
18
1
2
34
5
6
标准磷溶液/mL
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
dH2O/mL 定磷试剂/mL
1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
用漩涡混合器混匀，45℃恒温水浴保温25分钟用去离子水作为空白，660nm测定吸光值
A660(1)
A660(2)
回收率 0.15 100%
1000
(2) 计算样品总磷量：
x 50
RNA总磷量(g
/ mL)

1.5 回收率
(3) 计算RNA量：
RNA质量浓度（g / mL) （总磷量无机磷量 DNA含量 9.9%） 10.5
总磷量 10.5
(4) 样品RNA含量：
样品RNA质量分数(%) RNA质量浓度(g / mL) 100% 2000(g / mL)
15
操作注意事项
1. 每人独立操作，不允许两人穿插取样； 2. 要求试剂及所有器皿清洁，不含磷； 3. 每管加样和测定均要求平行操作； 4. 消化溶液定容后务必上下颠倒混匀后再取样； 5. 各种试剂必须用移液管按顺序准确量取，移液管口用吸水

紫外分光光谱法和化学法测定核酸含量

第八章
紫外吸收光谱法及化学法测定核酸含量
实验原理
o 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健（C＝CC＝C ），能够强烈吸收250～280nm波长的紫外光。核酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm左右。核酸、核苷酸及其衍生物分子组成中都含有这些碱基，因而具有吸收紫外光的作用。遵照LambertBeer定律，可以从紫外吸收光谱的变化来测定核酸类物质的含量。
o 当已知ε（p）时，只要将被测核酸溶液在紫外分光光度计260nm波长处，通过光径为1cm的比色杯，测得OD值，即可测得该核酸溶液的浓度。 o 现已知RNA的ε（p）在260nm（pH7）时为 7700～7800，RNA的磷含量约为9.5%。因此，每毫升溶液（中性）含1μg的RNA钠盐，在 260nm波长处通过光径为1cm的比色杯时的光密度相当于0.020～0.024
o 化学法DNA含量的的原理： o DNA在强酸条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键断裂。生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。脱氧核糖在酸性条件下脱水生成酮基戊糖，后者与二苯胺在酸性条件下生成蓝色物质，在597nm波长处有最大吸收。
实验器材
o 紫外分光光度计
实验方法
o 1．碱基、核苷、核苷酸的定性测定 o 现在已经知道碱基、核苷、核苷酸在一定pH值时有4个特定的紫外光吸收值（光密度）的比值是固定的。要鉴别测得的未知样品中这些成分，只要测定它们在一定pH条件下如下几个特定波长（250nm，260nm，280nm，290nm）紫外光的吸收值（光密度），然后根据其光密度比值（250nm/260nm，280nm/260nm， 290nm/260nm）即可鉴别碱基、核苷和核苷酸。

核酸纯度鉴定的方法和原理

核酸纯度鉴定的方法和原理核酸纯度鉴定是在实验室中常用的核酸质量控制方法之一。

在进行分子生物学研究、基因克隆、PCR反应、基因测序等实验过程中，准确评估核酸的纯度是确保实验结果准确可靠的重要步骤。

核酸纯度的鉴定方法主要包括比色法、比浊法、紫外吸收光谱法等。

其中，紫外吸收光谱法是最常见且最常用的一种方法。

紫外吸收光谱法是利用核酸在紫外光（200-300 nm）波长范围内的特征吸收来评估核酸的纯度。

纯的核酸在260 nm处有一个最大吸收峰，而蛋白质、有机物等可能存在的污染物则往往在280 nm处有吸收峰。

因此，通过测量核酸在260 nm 和280 nm处的吸光度比值（A260/A280），可以初步判断核酸的纯度。

一般来说，纯度良好的DNA样品的A260/A280比值应在1.8-2.0之间，而纯度良好的RNA样品则应在1.9-2.1之间。

除了A260/A280比值，还有一个常用的指标是A260/A230比值。

这个比值是衡量核酸样品中存在的有机物污染程度的指标。

在制备核酸样品时，常常会使用一些试剂，如酚/氯仿、异丙醇等，这些试剂残留在核酸样品中会导致A260/A230比值下降。

一般来说，纯度良好的DNA样品的A260/A230比值应在2.0-2.2之间，而纯度良好的RNA样品则应在2.0以上。

此外，可以通过琼脂糖凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等方法进一步鉴定核酸纯度。

这些方法可以更加精确地确定核酸样品中的杂质含量，并进一步评估核酸的质量。

综上所述，核酸纯度鉴定的方法主要包括紫外吸收光谱法，通过测量A260/A280和A260/A230比值来初步评估核酸的纯度。

此外，还可以采用其他分析方法，如凝胶电泳、高效液相色谱等，来进一步确定核酸纯度。

这些方法的应用可以确保实验结果的准确性，并为后续实验提供良好的实验基础。

实验 DNA的琼脂糖凝胶电泳紫外吸收法测定核酸的含量

实验 DNA的琼脂糖凝胶电泳
紫外吸收法测定核酸的含量
【实验预习】
– 凝胶电泳分为哪几种？
–
在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带
——电，在电场中向——极移动？
– – –
什么是琼脂糖，它随温度有怎样的变化？影响核酸分子的迁移率的因素有哪些？核酸在——有特征吸收峰？蛋白质在——有特征吸收峰？
2. DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
3.琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系： 1)核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系：（1）DNA分子的大小在凝胶中，DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当 DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值;（2）琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.9 0.5～7 0.6 1～20 1.2 0.9～6 0.7 0.8～10 1.5 0.2～3 0.9 0.5～7 12.0 0.1～2
6. 蛋白质也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的 260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与 280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。

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• 不同形式DNA紫外光密度不同，因为DNA具有双螺旋结构，当过量的酸、碱或加热使DNA变性时，则出现ε（P）260nm值升高的增色效应。在核苷酸量相同的情况下，ε（P）260nm有以下关系：单核苷酸>单链DNA>双链DNA。DNA变性后，双螺旋结构被破坏，碱基充分暴露，导致紫外光密度增加，还可根据DNA溶液在260nm处光密度的变化监测DNA变性情况。变性DNA复性后，ε（P） 260nm值降低，称为减色效应。
通常：1 OD=50ug/ml 1 OD=40ug/ml 1 OD=37ug/ml
dsDNA ssR酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵—过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液在260nm处的光密度作为对照。具体操作如下。 • 取两支小离心管，A管加入0.5ml样品和0.5ml蒸馏水，B管加入0.5ml样品和0.5ml钼酸铵—过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴中放置30min，3000r/min离心10min，从A、B两管中分别吸取0.4ml上清液到两个50ml容量瓶内，定容至刻度。在紫外分光光度计上测定260nm处的光密度。 • 式中 ΔOD260nm--A管稀释液与B管稀释液在260nm波长处的光密度之差。
实验十二紫外吸收法测定核酸含量
实验目的
• （1）掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理。 • （2）掌握利用紫外分光光度计测定核酸含量的方法
原
理
• DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在 260nm波长处。紫外吸收使嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的性质，所有含嘌呤和嘧啶的物质，都具有吸收紫外线的特性。核酸和核苷酸的摩尔吸收系数用ε（P）表示。ε（P）为每升溶液中含有 1mol核酸磷时的光密度（即吸光度或光吸收）。 RNA的ε（P）为7700～7800，RNA中磷的质量分数约为9.5%，因此每毫升溶液中含1.0μg RNA的光密度为0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε（P）（260nm，pH7）为6600，含磷的质量分数为9.2%，因此每毫升溶液中含1.0μg DNA钠盐的光密度为 0.020。
• 蛋白质由于含有芳香氨基酸，也能吸收紫外光。蛋白质的吸收峰在280nm,260nm处的光密度仅为核酸的1/10或更低，因此核酸样品只能够蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在 260nm与280nm处的光密度的比值在2.0以上， DNA在260nm与280nm处的光密度的比值为1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时该比值会下降。紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3μg/ml的检测水平。
操作方法
• 一、将样品配制成每毫升含550g的核酸溶液，与紫外分光光度计上测定260nm处的光密度值，按下式计算核酸浓度和两者的吸收比值。 • 式中 OD260nm—260nm波长处的光密度值； • L—比色杯的厚度，一般为1cm或0.5cm； • 0.024—每毫升溶液内含1.0μg RNA的光密度值； • 0.020—每毫升溶液内含1.0μg DNA钠盐的光密度值。

紫外吸收法测定核酸含量

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