H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株HA1蛋白的原核表达
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禽流感H9亚型流行现状及控制策略页数:52
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H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定页数:6
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H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白中和抗原表位的分析的开题报告
H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白中和抗原表位的分析的开题
报告
题目：H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白中和抗原表位的分析
一、研究背景
近年来，H9N2亚型禽流感病毒在全球范围内广泛传播，成为世界范围内一个严
重的家禽和人类健康问题。
由于病毒的高变异性，现有的预防和治疗手段已经无法满
足对病毒的有效控制，因此急需研究H9N2亚型禽流感病毒的中和抗原表位，以帮助
开发有效的疫苗和药物。
二、研究目的
本研究旨在通过分析H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的中和抗原表位，了解
H9N2亚型禽流感病毒在人体免疫系统中诱导中和抗体的机理，为控制和预防H9N2亚型禽流感病毒提供科学依据。
三、研究内容
1. 采集H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白样本。
2. 通过Western blotting和ELISA等方法鉴定HA蛋白的免疫原性。
3. 构建HA蛋白的三维结构模型，预测可能的中和抗原表位。
4. 利用生物信息学和功能分析等方法验证中和抗原表位的有效性。
5. 尝试与免疫动物进行免疫实验，观察中和抗体的产生情况。
四、研究意义
本研究将对深入理解H9N2亚型禽流感病毒的免疫学特性和病毒的传播机制等方面具有重要的基础性和应用性意义，为防控病毒的传播和预防病毒感染提供科学支持。
五、研究进展
目前已经采集到了H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的样本，正在进行免疫原性的
鉴定，并进行三维结构模型的构建。
接下来将根据模型预测可能的中和抗原表位，进
一步开展验证和研究工作。
H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的原核表达
H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的原核表达杨理凯;郭苗苗;杜伟立;丁锐;王令;张涛;路宏朝【摘要】血凝素(hemagglutinin,HA)是禽流感病毒的主要抗原之一,原核表达HA 是该抗原特性研究和疫苗制备的关键.利用分子生物学方法构建H5N1亚型的禽流感病毒HA基因原核表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta菌株,用不同IPTG浓度和时间诱导HA表达,检测蛋白表达量,分析不同诱导条件对HA表达效率的影响,以确定最佳诱导条件.重组表达载体pET32a-HA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定,获得预期大小的DNA片段,说明HA基因成功插入质粒pET32a.Western blot检测结果表明,IPTG诱导重组菌株成功表达HA蛋白,当诱导浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为6 h时,HA蛋白表达量最高.研究结果为HA抗原制备及禽流感疫苗的研究奠定基础.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2018(039)008【总页数】5页(P10-14)【关键词】禽流感病毒;血凝素;原核表达;诱导条件【作者】杨理凯;郭苗苗;杜伟立;丁锐;王令;张涛;路宏朝【作者单位】陕西理工大学生物科学与工程学院 ,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院 ,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院 ,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院 ,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院 ,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院 ,陕西汉中723001;陕西理工大学生物科学与工程学院 ,陕西汉中723001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5;Q786禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)基因组由单股、负链、8个不连续片段的RNA组成，根据表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)与神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的抗原性差异，可进一步分为18种HA亚型和11种NA 亚型[1-2]。
H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因分子流行病学研究的开题报告
H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因分子流行病学研
究的开题报告
1. 研究背景
H9N2亚型禽流感病毒是一种致病性较低的禽流感病毒亚型，但近年来发现在亚洲地区已成为禽类的主要病原体，且存在突变和重组的可能，给人类健康带来了潜在威胁。
其中HA蛋白是病毒的主要外周结构蛋白，具有决定病毒免疫原性和与宿主细胞受体结合的重要功能。
2. 研究目的
本研究旨在对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因进行分子流行病学研究，包括序列分析、流行病学调查及其与宿主受体的结合特性研究，
为疫情监测以及防控提供基础数据支持。
3. 研究内容与方法
（1）分析国内外已公布的H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白序列，进
行同源性比对、基因演化分析、保守性结构域分析等。
（2）采集不同来源禽类样品，对H9N2亚型禽流感病毒进行流行病学调查及分离鉴定，获取病毒株。
（3）利用重组表达技术、蛋白纯化技术及生物物理化学方法，对
H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白进行表达和纯化，制备重组蛋白，并进行
质量控制。
（4）采用表面等离子体共振技术、结晶学技术等方法，研究H9N2
亚型禽流感病毒HA蛋白与宿主受体的结合性质及相关结构信息。
（5）通过统计分析和模型预测，探讨HA蛋白分子变异的规律，为
后续流行病学动态监测和病毒演化预测提供依据。
4. 研究意义
通过对H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白基因的分子流行病学研究，可以深入了解其分子特征、演化规律、宿主受体结合特性等，为病毒流行病学调查、疫情监测以及疫苗设计等提供基础数据支持，也为预测和评估其对人类健康的潜在危害提供参考。
一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的致病性及其HA基因遗传进化分析
程 技术 服务 有 限公 司产 品。 １ ． ２ 方法
１ ． ２ ． １ 病 毒 致 病 性 试 验
１ ． ２ ． １ ． １ 鸡 胚 最 小 致 死 量 的平 均 致 死 时 间 （ ＭＤ Ｔ） 测定 将分 离 株 ３代 毒 液用 Ｐ Ｂ Ｓ稀 释液 做 １ ０倍 系 列 稀释 ， 接种 １ ０ 日龄 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 胚 ， 连续 ７ ｄ在 相应 接
系的 Ａ／ ｃ ｈ ｉ ｃ ｋ ｅ ｎ ／ Ｂｅ Ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ ／ ９ ４ （ Ｈ９ Ｎ２ ） 和 Ａ／ ｃ ｈ ｉ ｃ ｋ ｅ ｎ ／ Ｈｏ ｎ ｇ ｋ ｏ ｎ ｇ ／ Ｇ９ ／ ９ ７ （ Ｈ９ Ｎ２ ） 的一 个分 支 。
关键 词 ： 禽流 感病毒 ； Ｈ９ Ｎ２亚 型 ； 蛋鸡； 致病 性 ； 遗传 进化
Ｆｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ Ｐｕｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ Ｋｉ ｔ Ｖｅ ｒ ． ２、Ｍ ｉ ｎｉ ＢＥＳＴ Ｐｌ ａ ｓ —
ｍｉ ｄ Ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ大 连） 有 限公 司产 品 ； Ａｍｐ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｎ ｔ ｒ ｉ ｈ ｙ ｄ ｒ ａ ｔ ｅ ， 上海 生工 生物 工
为新 疆 禽流感 的 防控提供 依据 。
种 时 间记录 每一 鸡 胚 的 死 亡 时 间 ， 并 测定 每 胚 尿 囊 液 的 ＨＡ 活性 ， 计算 ＭＤ Ｔ值 。
１ ． ２ ． １ ． ２ 脑 内接种 致病 指数 （ Ｉ Ｃ Ｐ Ｉ ） 测定 将 分离株 ３ 代毒 液用 Ｐ Ｂ Ｓ稀 释 液 １：１ ０稀 释 后 ， 经脑 内接种 １ ｏ 只 １日龄 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 ， 每 只接种 Ｏ ． Ｏ ５ ｍＬ。连续 ８ ｄ在 相 应 时间观察鸡群 发病 、 死亡情况 ， 计算 Ｉ Ｃ Ｐ Ｉ 值。
１ ． ２ ． １ 病 毒 致 病 性 试 验
１ ． ２ ． １ ． １ 鸡 胚 最 小 致 死 量 的平 均 致 死 时 间 （ ＭＤ Ｔ） 测定 将分 离 株 ３代 毒 液用 Ｐ Ｂ Ｓ稀 释液 做 １ ０倍 系 列 稀释 ， 接种 １ ０ 日龄 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 胚 ， 连续 ７ ｄ在 相应 接
系的 Ａ／ ｃ ｈ ｉ ｃ ｋ ｅ ｎ ／ Ｂｅ Ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ ／ ９ ４ （ Ｈ９ Ｎ２ ） 和 Ａ／ ｃ ｈ ｉ ｃ ｋ ｅ ｎ ／ Ｈｏ ｎ ｇ ｋ ｏ ｎ ｇ ／ Ｇ９ ／ ９ ７ （ Ｈ９ Ｎ２ ） 的一 个分 支 。
关键 词 ： 禽流 感病毒 ； Ｈ９ Ｎ２亚 型 ； 蛋鸡； 致病 性 ； 遗传 进化
Ｆｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ Ｐｕｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ Ｋｉ ｔ Ｖｅ ｒ ． ２、Ｍ ｉ ｎｉ ＢＥＳＴ Ｐｌ ａ ｓ —
ｍｉ ｄ Ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ大 连） 有 限公 司产 品 ； Ａｍｐ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｎ ｔ ｒ ｉ ｈ ｙ ｄ ｒ ａ ｔ ｅ ， 上海 生工 生物 工
为新 疆 禽流感 的 防控提供 依据 。
种 时 间记录 每一 鸡 胚 的 死 亡 时 间 ， 并 测定 每 胚 尿 囊 液 的 ＨＡ 活性 ， 计算 ＭＤ Ｔ值 。
１ ． ２ ． １ ． ２ 脑 内接种 致病 指数 （ Ｉ Ｃ Ｐ Ｉ ） 测定 将 分离株 ３ 代毒 液用 Ｐ Ｂ Ｓ稀 释 液 １：１ ０稀 释 后 ， 经脑 内接种 １ ｏ 只 １日龄 Ｓ Ｐ Ｆ鸡 ， 每 只接种 Ｏ ． Ｏ ５ ｍＬ。连续 ８ ｄ在 相 应 时间观察鸡群 发病 、 死亡情况 ， 计算 Ｉ Ｃ Ｐ Ｉ 值。
不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析
CHEN Lu, LIU Shou-chuan, ZHAO Jun, WANG Chuan-qing, WANG Zhe-lin
(Institute of Poultry Disease, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)
Abstract: 【Objective】 The objective of this experiment is to investigate the characteristics of pathogenic and antigenic variation of H9N2 subtybe avian influenza viruses isolated from 1998 to 2008 in China. 【Method】 The EID50, ELD50, MDT, ICPI, IVPI and the duration of shedding virus from infected 8-week-old SPF chickens of different H9N2 avian influenza viruses isolates were determined. The HI and VN activity of monoclonal antibody 2A4 and F6 on different H9N2 avian influenza viruses isolates were assayed and the HA genes of different antigenic reactive isolates were sequenced and analyzed. 【Result】 The determined pathogenicity suggested that the virulence of different isolates were different, thereinto, 3#, 12#, and 14# isolates showed higher pathogenicity than the others and could cause the death of SPF chickens. The 8-week-old SPF chickens infected by 3# or 12# isolate shed virus earlier and last for a longer time. 3 # and 12 # isolates showed specific response properties to monoclonal antibody 2A4 and F6. Monoclonal antibody 2A4 and F6 could inhibit the hemagglutinin activity of 3 # and 12 # isolates, however it could not neutralize the virus infection on CEF cells. HA sequence analysis showed that there was a single amino acid substitution of Ser (S)-to- Asn(N) at position 145 in the HA protein of 3 # and 12 # isolates, which led to the loss of reactivity to the monoclonal antibody 2A4 and F6 and the occurrence of a new potential glycosylation site NGT. The change of reactivity to the monoclonal
(Institute of Poultry Disease, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)
Abstract: 【Objective】 The objective of this experiment is to investigate the characteristics of pathogenic and antigenic variation of H9N2 subtybe avian influenza viruses isolated from 1998 to 2008 in China. 【Method】 The EID50, ELD50, MDT, ICPI, IVPI and the duration of shedding virus from infected 8-week-old SPF chickens of different H9N2 avian influenza viruses isolates were determined. The HI and VN activity of monoclonal antibody 2A4 and F6 on different H9N2 avian influenza viruses isolates were assayed and the HA genes of different antigenic reactive isolates were sequenced and analyzed. 【Result】 The determined pathogenicity suggested that the virulence of different isolates were different, thereinto, 3#, 12#, and 14# isolates showed higher pathogenicity than the others and could cause the death of SPF chickens. The 8-week-old SPF chickens infected by 3# or 12# isolate shed virus earlier and last for a longer time. 3 # and 12 # isolates showed specific response properties to monoclonal antibody 2A4 and F6. Monoclonal antibody 2A4 and F6 could inhibit the hemagglutinin activity of 3 # and 12 # isolates, however it could not neutralize the virus infection on CEF cells. HA sequence analysis showed that there was a single amino acid substitution of Ser (S)-to- Asn(N) at position 145 in the HA protein of 3 # and 12 # isolates, which led to the loss of reactivity to the monoclonal antibody 2A4 and F6 and the occurrence of a new potential glycosylation site NGT. The change of reactivity to the monoclonal
H9亚型禽流感病毒HA基因的真核表达及其功能的初步研究的开题报告
H9亚型禽流感病毒HA基因的真核表达及其功能的初步研
究的开题报告
1.研究背景
禽流感病毒是一种由禽类传播的高致病性病毒，能够引起禽流感病，并有可能对人类造成威胁。
其中H9亚型禽流感病毒是目前世界上广泛传播的一种亚型，已经引起了广泛的关注。
HA基因编码禽流感病毒表面的血凝素，是禽流感病毒的主要抗原，是禽流感病毒的研究热点之一。
2.研究目的
本次研究旨在探讨H9亚型禽流感病毒HA基因在真核细胞中的表达情况以及其功能的初步分析。
3.研究内容
（1）构建H9亚型禽流感病毒HA基因真核表达载体，并进行酵母菌双杂交实验，筛选HA基因可能的互作蛋白。
（2）将构建的HA基因真核表达载体转染至293T细胞中，利用Western blot检测HA 蛋白的表达量及其免疫原性。
（3）将HA基因真核表达系统转染至细胞中，利用定量PCR和荧光显微镜观察HA基因是否能够正确地表达、定位和结构成熟。
（4）利用免疫印迹和荧光显微镜等方法研究HA蛋白是否能够与细胞膜结合，并分析其在细胞生命周期中的分布和运动情况。
4.研究意义
本研究将为深入了解H9亚型禽流感病毒HA基因的功能以及其在病毒侵袭过程中的作用提供一定的参考。
同时，研究结果还将为开发新型的禽流感疫苗提供具体的理论基础和实验途径。
H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达
ＢＬ １ ｗｈｉｈ ｗａ ｄ ｃ ｉ ｔ ＰＴＧ， ｄ ｐｒｄｕ ｔ ｓ ｃ ｌ ｔｅ Ｔｈ ｘ ｒ ｓ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓ ｉｅ ｔ ｅｄｗｉ ２， ｃ ｓｌ ｕ ｔ ｗｉ Ｉ ｎ ｏｎ ｈ ａｎ ｏ ｃ ｌ ｗａ ｏ ｅｃ ｄ． ｅ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｐ ｏ ｅｎｗａ ｎ ｉ ｔ ｄ ｌ ｆ ｈ
达的蛋 白可被 禽流感 Ｈ９亚型阳性 血清特异性识 别。研 究结果表明 ，可 以用原核表达 系统 对禽流感病毒血凝素蛋
白进行表达 ，其产物具有免疫原性 ，可以用作禽流感抗体检测的免疫诊 断试 剂。 关键 词：禽流感 ；Ｈ９ ；原核表达 中图分类号：￥５ ． ￥ ５ ．５ ８ ５３ ８ ２ ； ６ 文献标志码 ：Ａ 文章编号：１０ — ３９ ２ １） ２ ０ ８ — ５ ０ ５ ９ ６ （０ １— ０ ６ ０ １
３ Ｓ ｈ ｏ ｆ ｉ ｃｅ ｃ ｓ Ｎｏｔ ｅ ｔ ｒ ｕｔｒ ｉｅ ｓ ｙ Ｈａ ｂｎ １ ０ ３ ， ｉａ ． ｃ ｏ Ｉ ｆ Ｓ ｉｎ ｅ ， ｒ ｓ ｉ ｌ ｅＵｎｖ ｒｉ ， ｒ ｉ ０ ０ Ｃｈｎ ） ｏ Ｌ ｅｎ ｆ ｖ ｎｉ ｕ ｎａｖｕ （ Ｉ） ａ ｘ ｒｓｅ ｙｐ Ｔｅ ｐｅ ｓ ｎｓｓ ｍｓｉ ｓｒ ｃ： ｈ Ａ ｐ ｔｉｏ ｉ ｆ ｅ ｚ ｒｓ Ｖ ｗ ｓ ｐｅｓ ｄｂ Ｅ ｘ ｒｓ ｉ ｙｔ ｏ ａａ ｎ ｌ ｉ Ａ ｅ ｏ ｅ ｎ
阅读 框 正 确 ， 获得 重 组 质 粒 ｐ Ｔ ０ — ９ Ｅ ３ ａ Ｈ 。将 此重 组 质 粒 转 化 到宿 主 菌 Ｂ ２ Ｌ １中 ，用诱 导 剂异 丙基 硫 代 一 半 乳糖 Ｄ
苷（Ｐ Ｇ） ＩＴ 进行诱 导，产物处理后进行 Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ Ｄ — Ａ Ｅ电泳 、免疫印迹和薄层扫描 分析 。结果发现 Ｈ Ａ蛋 白可被 大量表
H9N2亚型禽流感病毒HA基因真核和原核表达及其单因子血清的制备的开题报告
H9N2亚型禽流感病毒HA基因真核和原核表达及其单因子血清的制备的开题报告
1. 研究背景和意义
禽流感是由禽流感病毒引起的一种传染病，主要影响禽类动物，但有时也可传染给人。
其中，H9N2亚型禽流感病毒是最常见的亚型之一，对于禽类的养殖业和食品安全都有着重要的影响。
在现有的研究中，禽流感病毒HA (血凝素) 基因是重点研究的对象之一。
HA基因编码了病毒表面的血凝素蛋白，是病毒感染宿主细胞和诱导免疫应答的关键分子。
因此，研究禽流感病毒HA基因的真核和原核表达及其单因子血清制备，对于病毒的病理学、免疫学及其防控具有重要意义。
这也是本研究的研究重点和意义所在。
2. 研究内容和方法
本研究的主要内容和方法如下：
2.1 真核和原核表达禽流感病毒HA基因
针对H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列，设计引物并采用PCR 扩增，获得HA基因。
将这一HA基因克隆到真核和原核表达载体中，利用真核表达系统和原核表达系统分别表达HA蛋白。
2.2 单因子血清的制备
将表达的HA蛋白纯化并制备成单因子血清。
接着，对单因子血清进行免疫活性鉴定。
具体方法包括Western blot和ELISA等。
3. 预期结果和意义
本研究预计能够成功表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因，并获得对应的纯化蛋白。
此外，还将成功制备HA蛋白的单因子血清，并进一步验
证其免疫活性。
这些结果将为禽流感防控提供实验基础和技术支持，对于疫苗、诊断和防控具有重要意义。
禽流感病毒H5亚型HA1基因的原核表达及纯化
禽流感病毒H5亚型HA1基因的原核表达及纯化
乔宏兴;方先珍
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2011(046)001
【摘要】根据已报道的禽流感病毒H5 亚型HA1基因设计1对引物,利用RT-PCR 技术扩增目的基因片段,将扩增片段插入到pPROEX-HTb表达载体上,并对重组表达质粒进行PCR酶切鉴定,通过序列测定验证读码框,并在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达.结果表明:扩增出的1 000 bp的基因片段在大肠埃希氏菌中成功表达,蛋白产物约为38 ku,经western-blotting分析表明该融合蛋白具有很好的免疫原性.
【总页数】4页(P10-13)
【作者】乔宏兴;方先珍
【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校,河南,郑州,450002;河南省畜牧局动物疾病控制中心,河南,郑州,450011
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.H5N1亚型禽流感病毒M2基因的原核表达及纯化 [J], 王文娟;孟庆文;李贺;冉多良;刘光亮;肖一红;吴东来
2.H5禽流感病毒HA1基因原核表达及初步纯化 [J], 郑立运;王庆端;方先珍;江金
花
3.H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立 [J], 郑其升;张晓勇;刘华雷;李鹏;陈溥言
4.H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立 [J], 杨涛;刘明;张云;刘春国;杜绍范
5.H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测 [J], 齐岩;孙凌霜;王彬;孙进华;王君伟;师东方
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验
H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及免疫试验许佳敏，边海霞（宁夏家禽工程技术研究中心银川750001）更好防控H9N2亚型禽流感，且做到科学免疫，免疫减负。
本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料，将其无菌处理后接种SPF 鸡胚后进行病毒分离，通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定。
结果显示：分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒（AIV ）；血凝试验（HA ）效价在10～11，该病毒属于欧亚分支的BJ 亚分支。
将病毒纯化后，制备灭活疫苗免疫SPF 鸡，免疫后14d 对其进行HI 检测，结果显示其效价到达峰值为10Log2，免疫后28～35d 其平均效价在9.6Log2，至免疫后12周平均效价在7Log2。
结果说明本研究分离的病毒制备成疫苗后具有较好的免疫效果，可以作为疫苗候选株。
亚型禽流感毒株，免疫，疫苗禽流感是禽流行性感冒（avian Influenza ，AI ）的简称，是由正粘病毒科（orthomyxoviridae ）、流感病毒属（influenza virus ）、A 型流感病毒（influenza A virus ）引起的禽类疾病[1]。
国际兽医局（OIE ）将禽流感列为A 类动物疫病，我国也将其定为一类动物传染病。
H9N2禽流感病毒是低致病性亚型，在世界各地家禽群中流行。
目前，H9N2引起的禽流感在我国呈地方流行，虽然死亡率低，但感染蛋鸡出现鸡输卵管功能异常，产褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、软壳蛋，鸡群产蛋率下降30%～80%，病程持续时间长的可达月余，造成严重的经济损失[2]。
该疾病可通过免疫疫苗进行抵御但是由于低致病禽流感变异速度快，不同血清型之间交叉保护有限；所以筛选、免疫对型疫苗对养殖业具有重要意义[3]。
本研究通过分子病原学及血清学分离鉴定一株H9N2流行毒株，并进行动物试验，为进一步筛选疫苗提供理论依据。
1材料与方法1.1材料1.1.1病料来源疑似发病鸡病料，采集自宁夏平罗县某商品蛋鸡养殖场。
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碱基 。根据 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ 一 ６ ｐ 一 １的序 列 ， 在 质粒 多 克 隆 位 点 机 体产 生 中和 性 抗 体 ， 是 刺 激 机 体 产 生 保 护 性 免 疫 上 下游 设计 一对 可 以扩增 出 １ ８ ８ ｂ ｐ片段 的引 物 。上
游 引 物 ｐ ＧＥ Ｘ ５ ：５ 一 Ｇ ＧＧＣ ＴＧＧ Ｃ ＡＡＧＣ Ｃ ＡＣ Ｇ Ｔ — ＴＴ ＧＧＴ Ｇ一 ３ ， 下 游 引物 ｐ ＧＥ Ｘ ３ ： ５ ， ＿ Ｃ Ｃ ＧＧ ＧＡＧＣ Ｔ—
１ ． １ ． ２ 试剂 Ｔ ａ ｑ Ｄ ＮＡ 聚合 酶 、 ｄ ＮＴＰ ｓ 、 Ｍ— ＭＬ Ｖ 反转 录酶 、 Ｄ ＮＡ 琼脂 糖凝 胶 回收试 剂盒 、 ｐ ＭＤＴ 一 ２ ０ 一
Ｔ Ｖｅ ｃ ｔ ｏ ｒ 、 限制 性 内切 酶 Ｂａ ｍＨ Ｉ、 限制 性 内切 酶 Ｘｈ ｏ工、 Ｔ４ ＤＮＡ 连 接 酶 均 购 自宝 生 物 工 程 （ 大连） 有 限公 司 。表 达 载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ 一 ６ ｐ － １ ， 宿 主 菌 大 肠 埃 希 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 购 自Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｉ ａ公 司 。
禽 流感 是 由 Ａ 型 流 感 病 毒 引 起 的一 种 禽 类 的
感染 或 疾病 综 合 征 。 自 １ ９ ６ ６年 Ｈｏ Ｍｅ ｅ从 患 温 和
２ ０ １ ０年分 离 自辽 宁某 鸡场 病鸡 。Ｈ９ Ｎ２亚 型 禽流感
阳性 血 清 由青 岛澳 兰百 特生 物工 程有 限公 司提供 。
ＨＡ１ 基 因片段 ， 将扩 增得 到 的 ＨＡ１ 基 因克 隆至原核 表 达载 体 ｐ Ｏ Ｅ Ｘ 一 ６ ｐ 一 １中， 转化 到 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 中进行 表
达 。结果表 明 ， Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱 导融合 蛋 白表 达条 件确 定 最佳 诱 导 时 间为 ８ ｈ ，Ｉ Ｐ ＴＧ 最 佳 终 浓度 为 ０ ． ８ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ。
１ ． ２ 方 法
呼 吸道 病 的火鸡 中分 离到 第 １株 Ｈ９ Ｎ２亚 型禽 流感 病毒 后 ， 禽流感 在世界 范 围内迅速 流行［ １ ］ 。随 着 Ｈ９亚 型禽 流感病 毒灭 活疫 苗 的广 泛应 用 ， 低 致 病性 禽 流感 的疫情 有 所 缓解 ］ ， 但 近 年 来 随着 规 模 化 养
（ １ ． 青 岛农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 ， 山东青岛 ２ ６ ６ １ ０ ９ ； ２ ．青 岛 即墨 市 畜 牧 兽 医局 ， 山东 青 岛 ２ ６ ６ ２ ０ ０ ）
摘 要 ： 为表 达 Ｈ９ Ｎ２亚型 禽 流 感病 毒 的 ＨＡ１蛋 白， 从 Ｈ９ Ｎ２亚 型禽 流 感 病毒 辽 宁分 离株 中扩增 其
动 物 医学进展 ， ２ ０ １ ３ ， ３ ４ （ １ ０ ） ： ８ ９ — ９ １
Ｐｒ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎｅ
Ｈ９ Ｎ２亚型 禽 流 感 病 毒 辽 宁分 离株 ＨＡ１蛋 白的原 核 表 达
陈 欣 ， 张 乐萃 ， 卢春 晓。 ， 尹 燕博 ¨
ＧＡＴＣＣＧＡＴＡＡＡＡ ＴＣＴＧＣＡＴＣＧＧＣＴＡＴ一 ３ ， 上
三聚体 形 式存 在 于病 毒囊 膜 表 面 ， 对 病 毒 的 吸附 、 穿 游 引物 包含 Ｂ ａ ｍＨ Ｉ酶切 位 点 及 保 护碱 基 ； 下 游 引 膜、 宿 主 特 异 性 和 致 病 力 起 关 键 作 用［ ６ ］ 。ＨＡ 基 因 物 Ｐ ２ ： ５ ＇ － ＧＧ Ｃ ＴＣ ＧＡＧＴ Ｃ ＴＡＣ Ｔ ＡＧＡＴＣ ＴＡＧＡＡ —
ＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ一 ３ 。
经Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ ＡＧＥ和 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 分析 鉴定 ， 表达 产物 的分子质 量 约为 ６ １ ｋ ｕ 。 关 键词 ： Ｈｇ Ｎ ２亚型 禽流 感病 毒 ； 疫苗 ； 大肠 埃希 茵 ； 表 达
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９ ． ５ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ — ０ ０ ８ ９ — ０ ３
片段 的变 异是 导致 禽流感 病 毒遗 传 性状 改 变 的重 要 原 因之 一 。而且 ， 血 凝素 具有 亚 型特 异性 ， 能够 刺 激
应答 的主要 抗原 ］ 。ＨＡ是 由 ＨＡ１ 和 ＨＡ２亚 基 构
ＧＧＣ ＡＣ Ａ－ ３ ， 下游 引物 包 含 Ｘｈ ｏ Ｉ酶切位 点 及保 护
殖 的覆 盖 面 越来 越 广 ， Ｈ９亚 型禽 流 感 也 时 常发 生 ，
最主 要 的原 因就是 由于灭 活疫 苗免 疫 压力 下 的病 毒 变异 ， 造 成免 疫 失 败 。本 试 验 旨在 表 达 能 够 制 备 亚 单位 疫 苗 的蛋 白 ， 以预 防 Ｈ９亚型 禽 流感 。 禽流 感病 毒属 于正 黏病 毒科 ， Ａ 型流感 病 毒 属 ， 基 因组 由 ８段 线 状 单 股 负链 ＲＮＡ 构 成 ， 第 ４节 段 ＲＮＡ 编 码 病 毒 的血 凝 素 （ ｈ ｅ ｍａ ｇ ｇ ｌ ｕ ｔ ｉ ｎ ｉ ｎ ，ＨＡ） 蛋 白， ＨＡ 是 构成 病毒 囊膜 纤 突 的主 要 部分 之 一 ， 它以
１ ． ２ ． １ Ｐ Ｃ Ｒ 引 物 设 计 参 照 Ｇ ｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ登 录 的 Ｈｇ Ｎ２亚 型 禽 流 感 病 毒 的 ＨＡ 全 基 因 序 列 ， 使 用
Ｐ ｒ ｉ ｍｅ ｒ Ｐ ｒ ｅ ｍｉ ｅ ｒ ５ ． ０软件 ， 设 计 １对扩 增 ＨＡ１基 因
片 段 的 特 异 性 引 物。上 游 引 物 Ｐ １ ：５ 一 ＧＧ Ｇ—