MDA 多重置换扩增技术ppt课件

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• SNPs和STRs基因型检测 • 基因拷贝数改变的检测 • DNA测序
总的来说，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因组覆盖 率以及较低的扩增偏向性等优点，使得该方法成为目前最有优势的 WGA方法。MDA 已经广泛的应用于包括定量PCR、SNP基因型分 析、Southern印迹分析、染色体图谱中。
多重置换扩增（MDA）技术对单 细胞基因组测序技术研究进展
基因测序技术
• 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两 种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提出 的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法 这两种基本思想。
• 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测 序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、 成本贵，而且容易出错。
• 基于MDA的单细胞测序 • 主要研发人：深圳华大基因研究院 • 技术看点：将多重置换扩增(MDA)和测序技术相结合。 • 技术简介： • 本技术基于多重置换扩增(MDA)，并对该方法的扩增均一性、灵敏度、特异性等方面进行了全面
评估。这种将多重置换扩增和测序技术相结合的单细胞测序方法不仅具有更高的分辨率和基因组 覆盖度，而且具有更好的敏感性和特异性。该方法从单核苷酸水平上为各种复杂疾病和生物学过 程的研究开辟了新思路。
• 截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极 大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。
• 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法---单分子测序 （SMS）
• 多重置换扩增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998年 由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖于链 置换扩增原理，利用噬菌体Φ29DNA聚合酶，高度扩增DNA。 该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb 的 DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’ -5’外切酶活性， 错误率仅为5 x 10-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以 保证扩增的高保真性。
的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终我们可以
引
物 获得大量高分子量的DNA.
引 物
模板
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细胞分选
• 全基因组扩增(WGA)是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技 术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA 的总量。该 技术通过对微量组织样本，甚至单个细胞的整个基因组DNA扩增，再 将其扩增产物作为模板，进行后续分析，进而完成多位点、多基因以 及全基因组DNA 组成的研究。
• WGA技术发展至今主要IRS-PCR(interspersed repeat sequence PCR )、 LA-PCR(1inker adaptor PCR)、Alu PCR、T-PCR (tagged random primer PCR．T-PCR)、扩增前引物延伸(primer extension preamplification，PEP) 和简并寡核苷酸引物PCR (degenerate oligonucleotide primer-PCR，DOPPCR)。但是，由于发生非特异性扩增，位点覆盖不完全，DNA 产物片 段小于1 kb等缺点，限制了这些方法的应用。
• 对嵌合体形成酶路径的了解目前正被用来减少嵌合体的发生。
• 近日， Nature出版集团旗下刊物Scientific Reports刊发南方科技大学副教授贺 建奎课题组最新研究成果《单细胞基因组扩增法的定量评估及其在检测单个海 马神经元基因拷贝数变异的应用》，从多个角度评估了三种最常用的单细胞基 因组扩增方法。经过细致比较发现，MALBAC和GenomePlex WGA4的方法在 拷贝数变异检测方面明显优于MDA方法。
• Φ29DNA聚合酶强大的向前延伸活性和高保真度，使得通过 MDA可从极少量的DNA样本获取大量高质量的DNA，是到目前 为止对整个基因组覆盖最广、各位点扩增偏倚最小的WGA方法。
• 目前单细胞微生物可以通过对多重置换扩增反应（ MDA）得到的扩增 DNA进行测序。
• 在细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微克(10-6g)的高分子DNA也可直接作为模板供焦磷酸测序。
技术论文： • Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative
Neoplasm • Single-Cell Exome Sequencing Reveals Single-Nucleotide Mutation Characteristics of a Kidney
Tumor
近来对MDA 方法的改进：
• 减少MDA的反应体积：通过减少污染的扩增DNA和非特异性的合成，如引 物二聚体，本质上就是通过消除不必要的反应体积增强特异性的扩增。
• 通过使用60 nl微流控反应可提高扩增的特异性。
• 在MDA中，分支的DNA 中间体的形成可导致在一些对初始模板DNA链的 延长，然后被置换并对一个不同的模板延长，其结果是形成嵌合体。完整 的MDA反应物和S1核酸酶处理后可以消除DNA的单链形式，这可使使嵌合 体达到80％的减少。
• 单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强大的工具，它可用于对从 环境DNA的提取物（宏基因组序列）得到的多重有机体通过鸟枪法测 序来指导构建基因芯片。
多重置换扩增（MDA）的示意图：
首先随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接
下来Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，

它沿着DNA模板合成DNA,同时取代模板的互补链。被置换
MDA 反应的产量 受起始DNA浓度的 影响较小，Dean等 通过对不同量的模 板DNA进行MDA 反应，发现终产量 较一致。这对于大 范围的遗传学应 用十分有利，因为 不需要测量或平衡 DNA浓度而直接进 行扩增，而能产生 同样量的DNA。
初始模板量分别为：0.1ng,1ng,10ng,100ng，产量均为40μg左右。