酚酸类物质和氨基酸对西瓜专化型镰刀菌生长的影响

氨基酸叶面肥对西瓜品质和产量的影响作者：慕兰，葛树春，付秀云，高鹏来源：《中国果菜》 2018年第11期摘要：在常规施肥的基础上，于西瓜花期至成熟期间隔7~10 d用氨基酸叶面肥喷施5次。

结果发现，氨基酸叶面喷施处理，与清水对照相比，能使西瓜产量提高380.2~451.9 kg/667m2，增产率达到6.0%~7.2%，使西瓜平均含糖量提高0.5%~1.5%。

关键词：氨基酸叶面肥；西瓜；喷施；肥效中图分类号：S147.2 文献标志码：A 文章编号：1008-1038(2018)11-0026-03西瓜栽培历史悠久，种植地域广泛[1]。

开封地处豫东平原，气候温和，土壤多为沙质，适合西瓜生长[2]，是我国西瓜主要生产基地，年种植面积约4 万hm2[3]。

开封西瓜做为河南的地标产品，以其瓢沙脆甜，一直深受人们喜爱，素有“汴梁西瓜甲天下”的美誉[4]。

市场上叶面肥产品很多，但多数是增糖与增产相矛盾，或双重效果不理想[5-7]，如何提高西瓜的产量和品质，成为当下西瓜栽培的重要问题，本试验分析了氨基酸叶面肥对开封西瓜品质和产量的影响，探索了西瓜在增糖基础上的增产措施为西瓜高效栽培提供支持。

1 材料与方法1.1 试验地概况试验安排在尉氏县小陈乡圉村某西瓜田。

土壤类型为潮土，地势平坦，肥力均匀。

土壤有机质9.8 g/kg，全氮0.84 g/kg，有效磷12.6 mg/kg，速效钾85.5 mg/kg，pH值8.4。

前茬作物小麦每667 m2产量450 kg。

2016年4月25日西瓜移栽，移栽前每667 m2底施鸡粪325 kg、西瓜专用肥40 kg，6月17日每667 m2追施尿素、硫酸钾各10 kg。

供试西瓜品种为龙卷风，氨基酸叶面肥由成都新朝阳作物科学有限公司提供。

1.2 试验设计本试验设5个处理，随机区组排列，重复3次，每个试验小区20株（18 m2）。

5个处理分别为：处理1，清水对照；处理2，河南地区常规叶面肥（喷施宝）1500倍稀释；处理3，氨基酸叶面肥1500倍稀释；处理4，氨基酸叶面肥1000倍稀释；处理5，氨基酸叶面肥500倍稀释。

含氨基酸水溶肥料在西瓜上的示范试验总结许丁坛;许春霭【摘要】通过田间试验,研究了江门市杰士植物营养有限公司和其他企业生产的含氨基酸水溶肥料对西瓜生长、产量、品质等方面的影响.结果表明:与其他企业生产的含氨基酸水溶肥料相比,施用江门市杰士植物营养有限公司生产的含氨基酸水溶肥料对西瓜生长有着更好的促进作用,对西瓜营养生长、产量的提高、品质的改善、效益的提高效果较明显.【期刊名称】《农业研究与应用》【年(卷),期】2016(000)006【总页数】3页(P18-19,24)【关键词】含氨基酸水溶肥料;西瓜;产量;效益【作者】许丁坛;许春霭【作者单位】琼海市长坡镇农业服务中心,海南琼海571429;琼海市农产品质量安全检验检测站【正文语种】中文氨基酸水溶性叶面肥可以提高作物光合作用效率，增加作物产量［1-4］。

为验证江门市杰士植物营养有限公司生产的含氨基酸水溶肥料在西瓜上应用的实际效果，于2015年12月至2016年4月在海南省琼海市长坡镇青葛村委会后山坡村进行了含氨基酸水溶肥料在西瓜上的试验示范。

1.1 试验地点试验在琼海市长坡镇青葛村委会后山坡村进行，土壤土种为浅海沉积物黄色砖红壤浅黄赤土，土质为砂壤土，前茬作物为西瓜，肥力中等，有机质含量18.5 g/kg，速效氮为30.12 mg/kg，速效磷为43.38 mg/kg，速效钾为16.09 mg/kg，pH=6.01。

1.2 供试作物大棚无籽西瓜，品种：凤光，种植规格为450 株/667 m2，每株1条主蔓2条侧蔓，每株留2个瓜。

1.3 供试肥料主要供试肥料为由江门市杰士植物营养有限公司生产的含氨基酸水溶肥料（氨基酸≥100g/L，Zn+Mn+Fe≥20 g/L）。

1.4 试验设计试验示范面积4000 m2，试验小区面积150 m2，试验设3个处理：处理1，等量清水对照+常规施肥对照；处理2，江门市杰士植物营养有限公司生产的含氨基酸水溶肥料+常规施肥；处理3，其他企业生产的含氨基酸水溶肥料+常规施肥。

施用菌剂和氨基酸对蔬菜产量、品质及土壤生物化学性质的影响近年来,因滥用、过量施肥造成了蔬菜产量、品质下降及一系列土壤问题,引起了学者们的高度关注。

微生物菌剂和含氨基酸水溶肥两种新型肥料对解决该类问题起到了积极的作用。

本研究采用田间小区试验,通过减施化肥配施菌剂和含氨基酸水溶肥,研究其对设施茄子和松花菜产量、品质以及土壤指标的影响,探索合理替代常规过量施肥的有效减施方案。

进一步通过室内培养试验,研究氨基酸对菌剂微生物生长及溶磷效果的影响,以便解释配施氨基酸与菌剂的增效机理。

其主要研究结果如下:(1)在施用与不施用菌剂对比条件下,研究了菌剂对两种蔬菜生长及其土壤指标的影响。

结果表明,施用菌剂对松花菜和茄子产量、部分土壤指标的作用效果表现突出。

与对照处理相比,松花菜施用菌剂75L/hm~2时,其产量提高了25.83%,土壤有效磷含量和酶活性分别增加了32.89%、66.23%~70.80%;茄子施用菌剂150L/hm~2、75L/hm~2时,高剂量菌剂处理的产量提高了11.72%,低剂量菌剂处理产量未显著提高,土壤有效磷含量和酶活性分别提高了23.05%~36.07%、35.27%~50.77%。

(2)通过田间试验研究了减施化肥配施菌剂和含氨基酸水溶肥对松花菜生长、土壤化学及生物指标的影响。

结果表明,AM施肥模式对各指标的作用效果突出。

与常规施肥相比,AM处理的松花菜产量提高了11.05%;土壤速效钾含量增加了24.92%,硝态氮下降30.61%~66.17%,氨基酸氮替代部分化肥氮降低了淋溶风险;土壤碱性磷酸酶和蔗糖酶活性分别增加了18.07%、125.22%;土壤多样性指数提高了8.27%、72.42%,形成了以假单胞菌属为优势菌群,而常规处理以海单胞菌属为优势菌群的分布特征。

因此,AM施肥技术在设施松花菜上实现了减投增效,其应用具有可行性。

(3)通过田间试验研究了减施化肥配施菌剂和含氨基酸水溶肥在设施茄子上的应用效果。

防治西瓜枯萎病的微生物菌种的筛选与鉴定陈允亮;毛慧渊;陶黎明【摘要】[目的]对一组防治西瓜枯萎病的微生物菌种进行鉴定.[方法]以西瓜专化型尖孢镰刀菌为研究对象,从海洋海绵共生菌和土壤样品中筛选到6株具显著拮抗西瓜专化型尖孢镰刀菌的活性菌株,并对该6株活性菌株进行分子鉴定.[结果]分子鉴定显示该6株活性菌株均属于芽孢杆菌属的物种.[结论]试验结果为西瓜枯萎病类安全高效的生物农药及功能型生物肥料的创制提供了理论依据.%[Objective] The aim was to identify microorganism against watermelon Fusariumwilt.[Method] The Fusarium oxysporum f.sp. niveum was taken as the research object and six strains with significant antagonistic activity to Fusarium oxysporum f.sp.niveum from symbiotic bacteria of marine sponges and soil samples were screened, and the six active strains was identified through molecular biological characteriza-tion.[ Result] The molecular biological characterization showed that these six active strains all belonged to Bacillus.[ Conclusion] The conclu-sion of this study lays a foundation for new type of safe and efficient biological pesticide and functional biological fertilizer towards watermelon wilt.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2017(045)028【总页数】4页(P11-13,20)【关键词】枯萎病;生物防治;尖孢镰刀菌;芽孢杆菌【作者】陈允亮;毛慧渊;陶黎明【作者单位】复旦大学化学系,上海200433;镇江恒欣生物科技有限公司,江苏镇江212100;镇江恒欣生物科技有限公司,江苏镇江212100;华东理工大学药学院,上海200237【正文语种】中文【中图分类】S436.5Abstract [Objective] The aim was to identify microorganism against watermelon Fusarium wilt.[Method] The Fusarium oxysporum f.sp.niveum was taken as the research object and six strains with significant antagonistic activity to Fusarium oxysporum f.sp.niveum from symbiotic bacteria of marine sponges and soil samples were screened, and the six active strains was identified through molecular biological characterization.[Result] The molecular biological characterization showed that these six active strains all belonged to Bacillus.[Conclusion] The conclusion of this study lays a foundation for new type of safe and efficient biological pesticide and functional biological fertilizer towards watermelon wilt.Key words Wilt;Biological control;Fusarium oxysporum;Bacillus西瓜是我国重要的经济作物，其种植面积和产量均居世界第一位[1-2]。

中国瓜菜2021，34（11）：17-23收稿日期：2021-05-24；修回日期：2021-08-11基金项目：国家重点研发计划（2020YFD1000300）；西甜瓜产业技术体系（CARS-25）作者简介：唐思琪，女，在读硕士研究生，主要从事种子生产与加工。

E-mail ：************通信作者：戴思慧，女，副教授，主要从事西瓜、甜瓜种子生产与加工。

E-mail ：****************细菌性果斑病（Bacterial fruit blotch ，BFB ）是为害西甜瓜的重要病害之一，也是我国对内和对外的检疫对象，其病原菌是西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli ，Ac ），属于革兰氏染色阴性菌，是一种活体营养型细菌。

该病是典型的种传病害，严重影响瓜果品质和产量，在很多国家和地区都有发生。

目前，在我国的河南、内蒙古、山东、陕西、甘肃、新疆、海南等省（自治区）均有该病的报道[1]。

Ac 不仅能侵染25种药剂处理对西瓜种传细菌性果斑病菌的抑制效果唐思琪，孙小武，何长征，兰相祎，蔡雁平，戴思慧（湖南农业大学园艺学院长沙410128）摘要：细菌性果斑病是一种为害西瓜生产的种传病害，病原菌为西瓜噬酸菌，种子消毒是防治细菌性果斑病的首要措施。

采用平板抑菌圈法从25种杀菌剂中筛选出8种对西瓜噬酸菌抑菌效果好的药剂，其中5000mg·L -1杀菌剂1号AS 平均抑菌圈直径最大；用这些药剂对带菌西瓜种子进行处理，结果表明，5000、2500、1250mg·L -1的杀菌剂1号AS ，1000、2000mg·L -1的25%寡糖·乙蒜素ME ，100000mg·L -1的80%乙蒜素EC 和300、150mg·L -1的3%噻霉酮WP 都有较好的杀菌效果，其中25%寡糖·乙蒜素ME 和杀菌剂1号AS 虽有杀菌作用，但浓度过高会影响种子萌发；100000mg·L -180%乙蒜素EC 处理的种子发芽率与对照相比提高了22.22%，300、150mg·L -1的3%噻霉酮WP 处理的种子发芽率分别比对照提高58.73%、53.97%。

西瓜嗜酸菌趋化性的初步研究作者：杨姗姗孙柏欣王铁霖来源：《植物保护》2016年第03期摘要瓜类细菌性果斑病是世界范围的检疫性细菌病害，病原菌为西瓜嗜酸菌，带菌种子为主要侵染源。

病原细菌在寄主表面的定殖能力与其致病能力关系密切，而趋化性是决定定殖能力的关键因素之一，研究不同物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响对防治瓜类细菌性果斑病具有重要意义。

本文采用毛细管法，研究了碳源、氨基酸、有机酸及其他物质对西瓜嗜酸菌趋化性的影响。

结果表明，所测碳源中，麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖均显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性；所测氨基酸中，L精氨酸、L天冬氨酸、L组氨酸、L谷氨酸、L亮氨酸、L缬氨酸、L谷氨酰胺和L丙氨酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性；所测有机酸中，琥珀酸、半乳糖醛酸和酒石酸显著促进西瓜嗜酸菌的趋化性；氯化钠、硫酸镁等对西瓜嗜酸菌的趋化性无显著影响。

关键词西瓜嗜酸菌；趋化性；毛细管法中图分类号：S 436.5文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.028AbstractBacterial fruit blotch （BFB）is a worldwide quarantine disease， caused by Acidovorax citrulli， and seeds carrying bacteria are the main source of infection. The colonization of pathogenic bacteria in hosts is highly related to virulence， and chemotaxis is a key factor to the colonization of A. citrulli. Studying the effect of different substances on the chemotaxis of A. citrulli played a great role in preventing BFB. In this study， capillary method was used to determine the effects of carbon， amino acids， and organic acids on the chemotaxis of A. citrulli. The results showed that，among the carbon resources， maltose， glucose， lactose， sucrose， and galactose significantly promoted the chemotaxis of A.citrulli； among the amino acids， Larginine， Laspartic acid，Lhistidine， Lglutamic acid， Lleucine， Lvaline， Lglutamine and Lalanine significantly promoted its chemotaxis； among the organic acids， succinic acid， galacturonic acid and tartaric acidsignificantly promoted chemotaxis of A.citrulli； other substances such as NaCl and MgSO4 had no significant effect on its chemotaxis.Key wordsAcidovorax citrulli；chemotaxis；capillary method瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch，简称BFB）是世界范围的检疫性细菌病害，主要危害西瓜、甜瓜、黄瓜等葫芦科作物，造成重大的经济损失。

西瓜新炭疽病菌的鉴定、生物学特性及药剂敏感性研究作者：靳俊媛王友贤刘倩孙蕾白庆荣赵廷昌来源：《中国瓜菜》2022年第08期摘要：為了明确2018—2021年在吉林省及周边地区发现的一种西瓜炭疽病新病原菌的分类地位，探究其防治方法，采用组织分离法获得培养形状一致的52个菌株，柯氏验证结果表明其代表菌株具有致病性，结合形态学和分子生物学特征将该病原菌鉴定为菜豆炭疽菌Colletotrichum incanum。

生物学特性观察结果表明：C. incanum菌丝生长的最适培养基为PDA，最佳pH值为5，最适氮源为甘氨酸，最适碳源为淀粉，最适温度为30 ℃，最适光照条件为全光照;产孢最适培养基为CMA，最适pH值为5，最佳氮源为甘氨酸，最佳碳源为麦芽糖，最适温度为10 ℃，在全黑暗条件下产孢最佳。

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法对该病原菌进行室内药剂敏感性测定。

结果表明，在菌丝生长和孢子萌发方面，该病原菌对25%吡唑醚菌酯SC、350 g·L-1苯甲·嘧菌酯SC、560 g·L-1嘧菌·百菌清SC和40%嘧菌·戊唑醇SC敏感性均较好，可作为该病害防治的优先选用药剂。

关键词：西瓜炭疽病;Colletotrichum incanum;病原鉴定;生物学特性;药剂敏感性中图分类号：S651 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2022）08-018-09Identification， biological characteristics and fungicide susceptibility of the new pathogen Colletotrichum incanum of watermelon anthracnoseJIN Junyuan1， WANG Youxian2， LIU Qian3， SUN Lei1， BAI Qingrong1， ZHAO Tingchang4（1. College of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jilin，China; 2. Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Brigade of Jiaohe City in Jilin Province， Jiaohe 132500， Jilin， China; 3. Comprehensive Service Center of Heishui Town （Agricultural Technology Extension Station）， Taonan 137100， Jilin， China; 4. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100096， China）Abstract： To clarify the taxonomic status and conduct research on prevention of a new pathogen of watermelon anthracnose in Jilin Province during 2018-2021， 52 isolates were collected by tissue isolate method with consistent culture characteristics and the representative strains were tested for pathogenicity by the Koch's postulate in this study. The pathogen was identified as Colletotrichum incanum by morphological characteristics and sequence analysis. The optimum culture medium， pH， carbon source， temperature and light of mycelial growth were PDA， pH 5，glycine， starch， 30 ℃ and full light， respectively. The optimal conditions of conidial production of C. incanum were CMA， pH 5， glycine， maltose， 10℃ and total darkness， respectively. Determination of indoor pesticide susceptibility of the fungus by mycelium growth rate method and conidial germination method. The mycelium and conidium of C. incanum were more susceptible to 25% pyrazoxystrobin SC， 350 g·L-1 difenoconazole·azoxystrobin SC， 560 g·L-1 azoxystrobin·chlorothalonil SC and 40% azoxystrobin·tebuconazole SC than other fungicides tested，which could be used as the preferred choices for the control of this disease.Key words：Watermelon anthracnose; Colletotrichum incanum; Pathogen identification; Biological characteristics; Fungicides susceptibility西瓜（Citrullus lanatus L.）是一年生蔓生草本植物[1]，其果肉味甜，能降温去暑;种子含油，可作消遣食品;果皮药用，有清热、利尿、降血压之效[2]，在我国各地均有栽培[3-4]。

西北农业学报 2022,31(2):224-232A c t aA gr i c u l t u r a eB o r e a l i -o c c i d e n t a l i sS i n i c a 网络出版日期:2022-01-17 d o i :10.7606/j.i s s n .1004-1389.2022.02.011网络出版地址:h t t ps ://k n s .c n k i .n e t /k c m s /d e t a i l /61.1220.s .20220117.0951.002.h t m l 乌头酸对尖孢镰刀菌百合专化型抑制作用分析收稿日期:2021-03-23 修回日期:2021-05-27基金项目:国家自然科学基金(31860549);兰州市科技计划(2017-4-95);甘肃农业大学学科建设基金(G A U -X K J S -2018-05)第一作者:王文珠,女,硕士研究生,研究方向为蔬菜栽培和生物技术㊂E -m a i l :1244715561@q q.c o m 通信作者:师桂英,女,博士,教授,硕士生导师,主要从事蔬菜栽培和生物技术研究㊂E -m a i l :s h i g y@g s a u .e d u .c n 王文珠1,师桂英1,苏国礼1,牟晓玲1,朱 艳2,杨宏羽1,李谋强3(1.甘肃农业大学园艺学院,兰州 730070;2.甘肃农业大学食品科学与工程学院,兰州 730070;3.临洮县龙门镇农技推广站,甘肃临洮 730500)摘 要 乌头酸是兰州百合一种重要的根系分泌物,为探究乌头酸对尖孢镰刀菌(F u s a r i u mo x y s p o r u m )百合专化型的作用效果,测定外源乌头酸对F .o x y s po r u m 生长及抗氧化酶活性基因表达量的影响㊂结果表明,浓度为1.175~1175m g ㊃L -1时,乌头酸对F .o x y s p o r u m 的生长具有抑制作用,且随着浓度增加,抑菌作用显著㊂浓度为1175m g ㊃L -1时,与C K 相比,乌头酸对F .o x y s po r u m 抑菌率㊁产孢量抑制率和孢子萌发抑制率分别达到91.95%㊁77%㊁93%㊂乌头酸处理引起菌丝体电导率增大,随着浓度和时间的增加,S O D ㊁P O D 活性呈现先增加后降低的趋势㊂S O D 酶合成基因在转录水平上于11.75~1175m g ㊃L -1处理下调表达,1.175m g ㊃L -1处理时S O D 酶合成基因出现上调,与C K 差异不显著㊂P O D 酶合成基因在转录水平上所有处理均下调表达㊂可见,乌头酸可以作为化感抑制剂应用于植物土传病害的防治㊂关键词 乌头酸;尖孢镰刀菌;生长;抗氧化酶;化感抑制剂中图分类号 S 644.1 文献标志码 A 文章编号 1004-1389(2022)02-0224-09酚酸物质是植物根系分泌物中重要的化感物质,对植物根际土壤微生物生长表现显著的化感作用㊂尖孢镰刀菌F u s a r i u mo x y s po r u m 是引起植物产生枯萎病的典型病原真菌[1]㊂该病原真菌从植物根部侵入,引起维管束病害,最终植株枯萎死亡[2]㊂枯萎病属于土传病害,与地上部分病害相比,防治工作相对困难[3]㊂利用酚酸类物质的化感抑制作用来防控枯萎病已成为近年来的研究热点㊂阐明根系酚酸类物质对镰刀菌生长的影响,是化感抑制剂应用研究的基础㊂该方面已有诸多文献报道㊂郝文雅等[4]研究表明,香豆酸对西瓜专化型尖孢镰刀菌孢子萌发㊁产孢能力㊁菌丝生长表现显著抑制作用;翟子翔等[5]认为,800μg ㊃m L -1浓度的肉桂酸对香蕉枯萎病尖孢镰刀菌抑制率最强㊂但是,另一些研究发现,某些酚酸类物质可以促进病原菌的生长,提高枯萎病的发生㊂王倩等[6]研究表明,苯甲酸和肉桂酸可以提高西瓜幼苗枯萎病的发病率;T i a n 等[7]发现,兰州百合根系分泌物邻苯二甲酸对枯萎病病原菌侵染能力有促进作用;类似结果在其他研究中也有报道㊂因此,酚酸物质对植物枯萎病菌的生长表现出促进或抑制作用与酚酸类物质的种类或含量有关[8-9]㊂乌头酸(A c o n i t i ca c i d ,C 6H 6O 6),又名丙烯-1,2,3-三羧酸,由于最先在乌头属植物(A c o n i t u mn a p e l l u s )中发现而得名㊂乌头酸是笔者所在课题组在兰州百合连作栽培土壤中首次报道的酚酸类化感物质[10]㊂兰州百合是中国唯一的甜百合㊂该作物狭域分布,无性繁殖,多年生栽培,主产区枯萎病发生十分严重㊂笔者所在课题组分离获得主产区枯萎病主要致病镰刀菌类群尖孢镰刀菌(F u s a r i u mo x y s po r u m )[11],证明镰刀菌属真菌的积累是引起兰州百合连作障碍的原因[12];同时,利用H P L C 方法,对0~9a 的兰州百合根际土壤进行分析,共检测到的11种酚物质,其中包括乌头酸在内的4种酚酸类物质含量较高(大于1μg ㊃g -1干土),而在这4种物质中,以乌头酸含量在各年份含量较为稳定[10]㊂已有研究人员在小麦[13]及葡萄[14]根系分别证明乌头酸是重要的根系分泌物,对尖孢镰刀菌具有抑制作用㊂因此,笔者推测乌头酸可能会对百合尖孢镰刀菌产生化感作用㊂基于以上背景,本试验选择乌头酸作为外源化感物质,依据该物质在兰州百合栽培土壤中的含量最大值8.9μg㊃g-1[10],以及孙明等[15]试验结果为参考,按0~1175m g㊃L-1设计浓度梯度,采用体外抑菌试验及分子生物学技术,研究该物质对尖孢镰刀菌的化感效应及其转录水平的分子调控机理,以期阐明该物质对镰刀菌的化感作用效果,为兰州百合枯萎病病原性连作障碍治理提供依据㊂1材料与方法1.1供试材料选用培养基中添加外源化感物质,离体培养微生物的方法㊂乌头酸,上海中秦化学试剂有限公司生产;尖孢镰刀菌(F u s a r i u mo x y s p o r u m),保存于甘肃农业大学园艺学院实验室4.0ħ冰箱中,作为病原菌试验材料㊂1.2试验方法1.2.1乌头酸对尖孢镰刀菌生长的测定设计5个不同乌头酸浓度处理,即C K(0m g㊃L-1)㊁T1(1.175m g㊃L-1)㊁T2(11.75m g㊃L-1)㊁T3 (117.5m g㊃L-1)㊁T4(1175m g㊃L-1),每处理3次重复㊂将尖孢镰刀菌菌饼(d=4mm)接种于添加不同浓度乌头酸的P D A培养基上,于28ħ下恒温培养7d㊂测定菌落直径直到第7天,每隔24h 测定1次,绘制菌落生长速率曲线并计算抑菌率㊂培养第7天后测量产孢量和计算产孢量抑制率㊂同时,采用载玻片法[16]观察并记录孢子萌发数㊂每个处理重复3次,按公式计算孢子萌发率和抑制率㊂菌落纯生长量=菌落直径-菌饼直径抑菌率=(对照皿菌落纯生长量-处理皿菌落纯生长量)/对照皿菌落纯生长量ˑ100%产孢量=(测量所得孢子数/80)ˑ400ˑ10000ˑ稀释倍数产孢量抑制率=[(对照菌落产孢量-处理菌落产孢量)/对照菌落产孢量]ˑ100%孢子萌发率=萌发个数/总孢子个数ˑ100%孢子萌发抑制率=(对照组萌发率-处理组萌发率)/对照组萌发率ˑ100%1.2.2尖孢镰刀菌细胞膜渗透性㊁可溶性蛋白含量㊁M D A含量和S O D㊁P O D酶活性的测定取新鲜菌饼,加入P D B培养基,在28ħ㊁140 r㊃m i n-1恒温摇床振荡培养5d后,取出菌丝团,收集菌丝体[17],置于-20ħ冰箱中保存㊂取0.2g菌丝体(湿质量),放入30m L不同浓度乌头酸溶液中,每处理重复3次,分别在0㊁5㊁15㊁30㊁60㊁90㊁120㊁150㊁180㊁240m i n时用电导仪(D D S J-308F)测定电导率㊂在60m L含不同浓度乌头酸的P D B培养基中加入2g菌丝体,恒温振荡培养,在12㊁24㊁48h 后取出菌丝体,准确称取0.5g,置于已放入少量磷酸盐缓冲液(P B S,p H=7.4)的研钵中,冰浴研磨成匀浆,将匀浆用P B S定容至10m L,于4ħ㊁10000r㊃m i n-1离心10m i n,取上清液用于各生理指标的测定㊂可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G250染色法;M D A含量的测定采用2-硫代巴比妥酸(T B A)法;S O D㊁P O D活性测定参照方法[18]㊂1.2.3乌头酸对尖孢镰刀菌S O D㊁P O D酶基因表达量的测定将已灭菌的玻璃纸平铺在含药培养基后接入4mm尖孢镰刀菌菌饼,28ħ避光培养㊂无菌水作对照,每个处理3次重复㊂培养5d 后,刮取玻璃纸表面的菌丝置于无酶离心管中,并快速放入液氮中冷冻,待其充分冷冻后置-80ħ冰箱中保存,待用㊂用真菌R N A提取试剂盒(F u n g a l R N A M i n i p r e p K i t)提取不同处理下菌丝体的R N A㊂利用超氧化物歧化酶合成相关基因特异性引物S O D F/R;过氧化物酶合成相关基因特异性引物P O D F/R[19];内参基因A c t i n引物参照齐兴柱等[20]的方法㊂由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)㊂反转录试剂盒(E v o M-M L V R T K i tw i t h g D N A C l e a n,A G,C h a n g s h a,C h i n a)合成c D N A;定量P C R仪(L i g h t C y c l e rʻR96R e a l-T i m eP C RS y s t e m,R o c h e,瑞士)和荧光定量试剂盒(S Y B R G r e e n P r e m i x P r o T a q H S Q p c r K i t,A G,C h a n g s h a,C h i n a)进行该基因在不同处理下表达量的分析㊂反应体系为20μL:c D N A 3μL,d d H2O5μL,上㊁下游引物各1μL,S Y B R 10μL㊂㊃522㊃2期王文珠等:乌头酸对尖孢镰刀菌百合专化型抑制作用分析表1 P C R 扩增引物T a b l e 1 P r i m e r s o fP C R基因G e n e上游引物(5'ң3')F o r w a r d p r i m e r下游引物(5'ң3')R e v e r s e p r i m e rS O DG G T C C T C A C T T C A A C C C T C A A G T C G G T G A C A G A G C C C T T AP O D C G A G G G A T G G A T C A A G G A T A G T A G C A T C C T G C T G G T C G A T A c t i nC C G T G A C A T C A A G G A G A A G CG G A A A G T G G A C A G G G A A G C A1.3 数据分析采用E x c e l2010处理数据并作图,采用S P S S22.0软件进行单因素方差分析(A N O V A )分析,以D u n c a n s 检验法进行多重比较㊂2 结果与分析2.1 乌头酸对尖孢镰刀菌生长的影响2.1.1 菌落 乌头酸对尖孢镰刀菌菌落生长有显著的抑制作用(P <0.05),随着乌头酸浓度的增大,其抑制效果增强(图1-A )㊂从第2天开始,与C K 相比,各处理尖孢镰刀菌菌落的生长速度产生明显差别,T 1㊁T 2㊁T 3㊁T 4处理的菌落生长变小(图1-A ,1-C )㊂T 1㊁T 2㊁T 3处理的抑菌率分别比C K 增加29.23%㊁33.95%和38.09%㊂T 4处理下,抑菌率值达到91.95%,与C K 差异显著(图1-B )㊂在培养第7天时,C K 菌落直径为66.34mm ,T 4菌落直径最小,为9.25mm (图1-C )㊂ A.菌落生长速率曲线;B .抑菌率;C .处理7d 的镰刀菌菌落生长情况;柱形图上不同小写字母表示差异显著(P <0.05),下同A.C u r v e o f c o l o n yg r o w t h r a t e ;B .I n h i b i t i o n r a t e ;C .C o l o n yg r o w t ho f F u s a r i u m i n 7d a y s ;d i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05),t h e s a m e b e l o w图1 乌头酸处理后尖孢镰刀菌生长情况F i g.1 G r o w t ho f F u s a r i u mo x y s p o r u m u n d e r t r e a t m e n t o f a c o n i t i c a c i d 2.1.2 产孢量及孢子萌发率 乌头酸对尖孢镰刀菌的产孢量有显著抑制作用(P <0.05)㊂随着乌头酸浓度的增加,尖孢镰刀菌的产孢量降低㊂与C K 相比,各处理产孢量发生变化,T 1㊁T 3处理产孢量较C K 差异不显著,T 2和T 4处理下产孢量显著降低,分别降低17%和77%(图2-A ),且产孢量抑制率分别达到17%与77%(图2-B );与C K 相比,T 1~T 4处理孢子萌发率均低于C K ,T 4处理孢子萌发率㊁孢子萌发抑制率分别是4%和93%,差异显著(P <0.05)(图2-C ,2-D )㊂随着乌头酸浓度的增大,孢子萌发数量发生改变,且T 4处理下孢子萌发个数明显减少(图2-E~2-H )㊂㊃622㊃西 北 农 业 学 报31卷A.产孢量;B.产孢量抑制率;C.孢子萌发率;D.孢子萌发抑制率;E㊁F㊁G㊁H分别代表处理C K㊁T2㊁T4㊁C K局部放大的孢子萌发情况;40倍镜下观察孢子萌发A.S p o r e p r o d u c t i o n;B.S p o r e p r o d u c t i o n i n h i b i t i o n r a t e;C.S p o r e g e r m i n a t i o n r a t e;D.S p o r e g e r m i n a t i o n i n h i b i t i o n r a t e;E,F,G,H r e p r e s e n tC K,T2,T4,a n d t h e l o c a lm a g n i f i c a t i o no fC K,r e s p e c t i v e l y;t h e s p o r e g e r m i n a t i o nu n d e r a40-f o l dm i c r o s c o p e图2乌头酸处理后尖孢镰刀菌产孢量与孢子萌发率F i g.2S p o r e y i e l da n d s p o r e g e r m i n a t i o n r a t e o f F u s a r i u mo x y s p o r u m u n d e r t r e a t m e n t o f a c o n i t i c a c i d2.2乌头酸对尖孢镰刀菌细胞膜通透性的影响乌头酸对尖孢镰刀菌菌丝体的细胞膜通透性有一定影响,乌头酸浓度越高,对菌丝体细胞膜破坏越大,菌丝体内电解质外泄越严重(图3)㊂在240m i n时,T4处理下的电导率值最大,为3590μS㊃c m-1,与C K相较,显著提升98.66%㊂说明乌头酸浓度越高,对菌丝体的细胞膜破坏越大,增大菌体通透性㊂2.3乌头酸对尖孢镰刀菌丙二醛含量和可溶性蛋白含量的影响培养12h后,与C K相比,T1㊁T2㊁T3㊁T4菌体M D A含量分别是C K的1.07㊁2.76㊁4.12㊁㊃722㊃2期王文珠等:乌头酸对尖孢镰刀菌百合专化型抑制作用分析4.06倍㊂由此说明,乌头酸处理引起菌体发生膜脂过氧化反应,提高了菌体M D A 含量,导致细胞膜受损,并且具有剂量依赖性(图4-A )㊂乌头酸处理降低菌体可溶性蛋白含量,与C K 相比,T 4处理菌体可溶性蛋白含量较C K 下降41.54%(图4-B )㊂表明乌头酸浓度越高,对尖孢镰刀菌的损伤越强㊂2.4 乌头酸对尖孢镰刀菌P O D 和S O D 酶活性的影响乌头酸处理对尖孢镰刀菌氧化还原酶活性有显著影响㊂12h 时随乌头酸浓度的增加,各处理S O D 活性均高于C K ㊂24h 时T 1㊁T 4处理S O D 活性高于C K ,但不显著,中间浓度值T 2和T 3处理活性下降,其中T 2处理,与C K 相比,S O D 活性降低0.14%㊂48h 时,所有处理S O D 活性均下降,与C K 相比,T 4处理S O D 活性下降65.06%㊂结果表明,随着浓度和培养时间的增加,S O D 活性呈先增加后下降趋势(图5-A )㊂乌头酸对尖孢镰刀菌菌丝体的P O D 活性有一定影响,12h 时P O D 活性C K~T 3处理变化不大,只有T 4处理P O D 活性达到最大值,24h 时各浓度处理下P O D 活性均高于C K ,与C K 相比,T 2和图3 乌头酸处理后尖孢镰刀菌菌丝体细胞膜的透性F i g .3 C e l lm e m b r a n e p e r m e a b i l i t y of F u s a r i u mo x y s p o r u m m yc e l i u mu nde r t r e a t m e n t of a c o n i t i c a c i d图4 乌头酸处理后尖孢镰刀菌菌丝体内M D A 含量(A )和可溶性蛋白含量(B )F i g.4 M D Ac o n t e n t (A )a n d s o l u b l e p r o t e i n c o n t e n t (B )i n F u s a r i u mo x y s p o r u m m yc e l i u mu nde r t r e a t m e n t of a c o n i t i c a c id 图5 不同浓度乌头酸处理后尖孢镰刀菌S O D (A )和P O D (B )酶活性F i g.5 A c t i v i t i e s o f S O D (A )a n dP O D (B )o f F u s a r i u mo x y s p o r u m u n d e r t r e a t m e n t o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a c o n i t i c a c i d㊃822㊃西 北 农 业 学 报31卷T4处理P O D活性上升3%和2.25%,差异显著㊂48h时各浓度处理下P O D活性均低于C K,与C K相比,T4处理P O D活性显著降低82.77%㊂结果表明,随着培养时间和浓度的增加,P O D活性呈先增加后降低趋势(图5-B)㊂2.5乌头酸对尖孢镰刀菌菌丝体S O D与P O D 酶基因表达量的影响乌头酸处理使S O D与P O D酶合成基因表达量发生变化㊂S O D酶合成基因在转录水平上下调表达,与C K相比,T2㊁T3㊁T4处理S O D酶合成基因下调,差异显著,T1处理下酶合成基因表达量高于C K,但不显著㊂在培养第5天后T2㊁T3㊁T4乌头酸处理下S O D基因表达量呈现下调,分别是C K的2.08ˑ10-7㊁2.50ˑ10-7㊁0.78倍(图6-A)㊂P O D酶合成基因在转录水平上下调表达,与C K相比,T1㊁T2㊁T3㊁T4乌头酸处理下P O D基因表达量均为下调且差异显著,分别是C K的0.05㊁0.03㊁0.06㊁0.09倍(图6-B)㊂图6不同浓度乌头酸处理后尖孢镰刀菌S O D(A)与P O D(B)酶基因表达量F i g.6S O D(A)a n dP O D(B)e n z y m e g e n e e x p r e s s i o no f F u s a r i u mo x y s p o r u mu n d e r d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a c o n i t i c a c i d3讨论乌头酸是重要的植物根系分泌物,在自然界中存在顺式和反式两种异构体㊂都萃颖[21]研究发现,高含反式乌头酸T A A的玉米叶片能显著抑制根结线虫病害且不影响植株正常生长㊂董艳等[13]研究 云麦47 和 绵阳29 两个小麦品种中根系分泌物,检测顺式乌头酸,发现小麦与蚕豆间作降低根际尖孢镰刀菌的数量,抑制蚕豆枯萎病的发生㊂上述研究均间接证明该物质对病原微生物的化感抑制效应㊂本研究结果表明:1175m g㊃L-1乌头酸处理对尖孢镰刀菌菌丝生长㊁孢子产生及萌发均具有显著的抑制作用,可引起菌落生长缓慢,产孢量下降,孢子萌发率降低;1.175~1175m g㊃L-1时,真菌细胞膜通透性增大,M D A含量增加,可溶性蛋白质含量降低,S O D与P O D活性呈先增加后下降趋势,乌头酸处理后期,S O D与P O D酶合成基因在转录水平上下调表达㊂本研究在离体条件进行试验,为该物质对病原微生物的化感抑制效应提供直接理论支持㊂孙鸿强[10]利用H P L C方法在兰州百合栽培土壤中的测到的乌头酸含量为3.70~8.9μg㊃g-1,而且该物质在不同连作栽培年限及不同生育时期的百合栽培土壤中含量均较为稳定㊂本研究中的T1处理,其浓度设计为1.175m g㊃L-1(与土壤浓度8.9μg㊃g-1相当),与C K相比,能够抑制尖孢镰刀菌菌丝生长和孢子萌发,但对产孢基本没有影响,总体表现抑制作用㊂孙明等[15]研究发现,反式乌头酸具有明显的杀南方根结线虫㊁大豆孢囊线虫的活性㊂反式乌头酸对南方根结线虫的使用浓度为100~1000μg㊃m L-1,最佳使用浓度为500μg㊃m L-1,对其死亡率为85.5%;对大豆孢囊线虫的使用浓度为200~1000μg㊃m L-1,最佳使用浓度为500μg㊃m L-1,对其死亡率为99.2%㊂上述乌头酸对线虫防控结论,为本研究结果提供了部分支持㊂本研究结果表明,在1.175~1175m g㊃L-1时,乌头酸对尖孢镰刀菌生长产生完全抑制作用㊂因此,该浓度为乌头酸进行百合枯萎病(镰刀菌为主要病原)的化感抑制剂防治试验设计提供参考㊂本研究在转录水平上揭示乌头酸对菌丝体造成伤害的分子机理㊂在真菌菌体遭受不同生物或非生物胁迫时[22],导致其孢内大量活性氧积累,㊃922㊃2期王文珠等:乌头酸对尖孢镰刀菌百合专化型抑制作用分析引起生物体内P O D与S O D等氧化还原酶类活性增加;但是,随着胁迫时间增加,氧化还原酶系统平衡遭到破坏,酶活性在后期下降㊂刘玲等[23]研究发现,随着总黄酮浓度和处理时间的增加,尖孢镰刀菌甜瓜专化型S O D和C A T活性总体呈先上升后下降的趋势㊂与本研究结果类似,随着乌头酸处理浓度和处理时间的增加,尖孢镰刀菌百合专化型S O D和P O D活性先增加后下降㊂本研究进一步采用R e a l-t i m eP C R技术分析乌头酸对菌丝体S O D及P O D酶基因表达量的影响,结果表明长时间的乌头酸处理引起真菌S O D与P O D 酶基因表达量下调,这与刘畅[24]研究结果一致㊂由此可知,长时间的乌头酸处理引起真菌S O D与P O D酶基因表达量下调是S O D及P O D酶活性下降的原因之一㊂在本试验中电导率增加㊁M D A 含量上升㊁可溶性蛋白含量下降,表明乌头酸处理破坏尖孢镰刀菌细胞膜的通透性,抑制兰州百合枯萎病菌生长㊂这与李珊珊等[25]研究结果类似㊂由此推论:长时间的乌头酸处理,可引起镰刀菌氧化还原酶等防御酶合成基因在转录水平上的下调表达,进而引起相关酶类合成受阻,酶活性降低,生物体内活性氧代谢失衡,氧化胁迫加剧,最终破坏菌丝体细胞膜完整性,对菌体造成伤害㊂在自然或正常的浓度范围内,反式乌头酸具有生物安全性,属食品添加剂㊂因此,该物质具有生态安全性,具备作为化感抑制剂防治土传病害应用的生态安全基础㊂近期关于小分子杀线虫毒素反式乌头酸生物合成途径及该毒素应用于植物根结线虫防治的研究也为该物质作为化感抑制剂的应用提供有价值的参考[21]㊂4结论乌头酸对尖孢镰刀菌的生长具有抑制作用,在1.175~1175m g㊃L-1时,随着浓度增加,抑菌效果明显,1175m g㊃L-1处理下抑菌效果最佳㊂乌头酸处理引起镰刀菌氧化还原酶类合成基因在转录水平上下调表达,导致菌体氧化胁迫加剧,破坏菌丝体细胞膜完整性,是其抑制镰刀菌生长的分子机制㊂参考文献R e f e r e n c e:[1]赵彦杰,宴文武,周蓉.食用百合茎腐病的发生规律及综合防治[J].安徽农业科学,2005,33(12):2294-2295.Z H A O YJ,Y A N W W,Z H O U R.O c c u r r e n c e a n d c o m p r e-h e n s i v e c o n t r o 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