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第5章 发酵菌种的制备

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生物技术制药习题答案

生物技术制药习题答案

第一章绪论选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。

2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。

3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。

简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。

代表产品如酒、醋、乙醇，乳酸，柠檬酸等。

（2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技术发展速度快。

代表产品有青霉素，链霉素，红霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。

发酵工程第五章发酵工业种子制备

发酵工程第五章发酵工业种子制备


种龄与接种量

接种龄

种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种 子罐或发酵罐时的培养时间 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，而 且会降低产量。


大量地接入培养成熟的菌种的优点：

缩短生长过程的延缓期，因而缩短了
发酵周期，提高了设备利用率


节约发酵培养的动力消耗
本章内容：

种子制备原理与技术 影响种子质量的因素
种子质量的控制措施
种子制备的放大原理与技术
种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件

生长活力强，延迟期短；
生理状态稳定；
浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强，生产能力稳定
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩 大培养的次数 级数愈少，愈利于简化工艺及控制， 并可减少种子罐污染杂菌的机会，减 少消毒及值班工作量，减少因种子罐 生长异常而造成的发酵波动。
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)
瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度
发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 生产规模 随工艺条件的改变作适当的调整
种子质量的判断方法

通常检测的培养液中参数

pH是否在种子要求的范围之内


糖、氨基氮、磷酸盐的含量
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
有无杂菌污染

其他参数，如接种前酶活、种子罐的 溶氧和尾气等
种子制备

步骤：

斜面培养基中活化；

扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培

第5章-发酵乳制品生产技术

第5章-发酵乳制品生产技术
冷却的目的是为了终止发酵过程,迅速而有效地抑 制酸乳中乳酸菌的生长,使酸乳的特征( 质地、口昧、 酸度等)达到所设定的要求。为确保成品具有理想的粘 稠度，冷却的条件需要柔和。
冷却方式有冷却室静止冷却和冷却隧道连续冷却两 种方式。
8.冷藏后熟
冷藏温度一般在2～7℃,最佳为5℃，冷藏的作用 除达到冷却一项中所列举的目的外,还有促进香味物 质产生,改善酸乳硬度的作用。
得更好，使酸奶成为一个稳定的凝固体。
预热、均质、杀菌和冷却都是在由预 热段、杀菌段、保持段、冷却段组成的 板式换热器和外接的均质机联合完成的。
（参见样图）：预热、真空浓缩、均质、杀菌、 冷却的设备流程
1 平衡罐 2 片式热交换器 3 真空浓缩罐 4 均质机 5 保温管 图.发酵乳制品的一般预处理
常用的稳定剂有：
明胶
果胶
琼脂
变性淀粉
4.脱气、预热、均质、杀菌、冷却
4.1脱气： 添加奶粉的标准化方法必须在随后进行脱气处 理，以减少牛奶中的空气。
脱气的目的： 改善均质机的工作条件 减少热处理过程中产生沉淀物 提高酸奶的粘稠性和稳定性 去除挥发性的异味
4.2均质：防止奶油上浮，并保持乳脂肪均匀 分布，改善酸奶的稳定性和稠度，获得良好的 质感。
直投式：乳酸菌纯培养物 继代式：母发酵剂 中间发酵剂 生产发酵剂
3、按使用菌种分
传统的菌种：保加利亚杆菌(Streptococcus thermophilus)和嗜热链球菌(Lactobacillus bugaricus)1比1或者1比2的混合菌种。
益生菌：
4、酸奶中添加的益生菌
益生菌是指能促进人体健康且能在人体肠 道内繁殖的一类微生物。在酸奶中使用的有：
2.砂糖、葡萄糖和甜味剂

第5章 发酵菌种的制备

第5章 发酵菌种的制备

二、诱变育种
（一）、诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染 色体畸变和基因突变两大类。
（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择
压硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
二、诱变育种 （三）、诱变育种的一般步骤 （P103） 诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。
8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳 源利用；
9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生 物活性物质和毒素，以保证安全。
发酵工程
1.3 工业生产常用的微生物菌种
地球上的微生物资源非常丰富，
目前已发现的仅占其总数的1%~5%，
而在工业生产中被利用的仅有数百种，
FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73～81
1.5 发酵高产菌种的选育
目的
防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量
开发新产品
1.5 发酵高产菌种的选育
方法
基因突变： 自然选育、诱变育种 基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化： 点突变、易位PCR、同序法
从形态的角度
菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖 产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
1.4 工业微生物菌种的分离
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌 采样（造纸厂） →80℃ 30 min处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4 d，选择有凹陷圈的菌落 26株为组成型 从285个土样中获得62株

第五章 发酵工业的种子制备

第五章 发酵工业的种子制备

种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作
量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动 级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难， 一般2-4级
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 随产物的品种及生产规模而定 随着工艺条件的改变作适当的调整
罐或发酵罐时的培养时间。
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对 较大，但是最终由实验结果定。
大量地接入培养成熟的菌种的优点：
缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，
提高了设备利用率
节约发酵培养的动力消耗
有利于减少染菌机会
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。 子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单
菌落
②接种时密一点，得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
（三）生产车间种子制备阶段
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量 的菌丝体。 菌丝体比孢子要有利：
三、丝状真菌发酵种子扩大培养
利用菌丝体作为接种物
不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物， 如生产赤霉素的菌种——藤仓赤霉 问题：难以获得均一的接种物 接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它 具有大量的生长点
四、放线菌发酵种子扩大培养
斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子 可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子
——便于操作，但需要更仔细的控制。
1、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培 养基应该是有利于孢子的生长。

发酵与酿造技术2.发酵菌种(曲)的制备

发酵与酿造技术2.发酵菌种(曲)的制备

γ射线
激光
8-AG
亚硝基甲基脲(NMU)
亚硝基乙基脲(NEU) 亚硝酸(NA) 氮芥(NM) 4-硝基喹啉 1-氧化物 乙烯亚胺(EI) 羟胺
2.诱变剂选择与使用
2.1诱变剂的选择对野生型菌株，单一诱变因素有时也能 取得好的效果，对老菌种重复使用单一诱变因素，突变 的效果不高，可利用复合因素来扩大诱变幅度、提高诱 变效果。 2.2 诱变剂的剂量选择 变异率取决于诱变剂量，而变异率与致死率之间有一定 关系，因此可以用致死率作为选择适宜剂量的依据。采 用致死率高的剂量，如90—99.9%致死率的剂量，虽然负 变株多，但变异幅度大；采用中等剂量如 75 － 80%或更 低的剂量，不会导致太多的负变株和形态突变株，出现 高产菌株的几率高，而且低剂量诱变剂可能更利于高产 菌株的遗传稳定。
自然选育操作步骤：
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。
单细胞(孢子)悬液的制备
平板分离
挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验
二、诱变育种

用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行 的筛选，称为诱变育种
诱变育种的理论基础是基因突变，即DNA分子结构中某一 部位发生变化。由各种物理、化学、生物的因素人工诱发基因 突变，引起微生物的遗传变异，可使菌种发生突变的频率和变 异的幅度得到提高，从而使筛选获得优良特性的变异菌株的几 率得到提高。但是诱发突变缺乏定向性，因此必须与大量的筛 选工作结合才能收到良好效果。
2.诱变剂选择与使用
化学诱变剂 物理 诱变剂
紫外线 快中子 X射线 碱基类似物 2-氨基嘌呤 5-溴尿嘧啶 8-氮鸟嘌呤 与碱基反应的物质 硫酸二乙酯(DES) 甲基磺酸乙酯(EMS) 亚硝基胍(NTG)
生物 DNA分子中插入或 缺失一个或几个碱 诱变剂 基物质

发酵种子制备的工艺流程

发酵种子制备的工艺流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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1. 种子筛选。

挑选饱满、无病害、无杂质的种子。

第五章 发酵过程及控制


（二）pH对发酵的影响
1、实例 例 pH对林可霉素发酵的影响 林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液 pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、
(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些
酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH 达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N 升高，发酵不再继续。 发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这 一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。
4，最适温度的确定 最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最 适于菌的生长或发酵产物的生成。 最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件 和菌体生长阶段有关。 最适发酵温度的选择
– 在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一 定好。 – 温度的选择要参考其它发酵条件。 – 温度的选择还应考虑培养基成分和浓度
一、分批发酵
1、分批发酵的定义
• 是指在一封闭系统内含有初始限量基质的
发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消
泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何 其它物质。发酵过程中培养基成分减少， 微生物得到繁殖。
2、分批发酵的特点
• 其物理，化学和生物参数都随时间
而变化，是一个不稳定的过程。
微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即
超过最高温度，微生物很快死亡；低于最
低温度，微生物代谢受到很大抑制，并不
马上死亡。这就是菌种保藏的原理。
3，温度对发酵的影响
• 影响各种酶的反应速率和蛋白质性质 • 影响发酵液的物理性质 • 影响生物合成的方向。
– 例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。 在低于30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。 当温度提高，合成四环素的比例也提高。在温度达 35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。

菌种制作精选文档

4
母种、原种和栽培种 5
第一节 母种的制作 ?通常分离或购买的母种数量有限，
难以满足生产需要，因此，必须 进行扩大繁殖。
6
第一节 母种的制作
一、培养基的制备
（一）常用的母种培养基配方（用量/1000 ml）
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
马铃薯（去皮）200 g，
葡萄糖
20 g，
琼脂
18-20 g，pH值自然。
21
第一节 母种的制作
菌种分离：采用无菌操作，将某种食用菌 从混杂的微生物群体中分离出来进行纯 培养，从而获得纯菌丝体的方法，称为 菌种分离，分离所得的纯菌丝体即为原 始母种。
依据分离材料的不同，菌种分离的方法可 分为三类，即孢子分离法、组织分离法 和基内菌丝分离法。
22
第一节 母种的制作
组织分离
孢子分离分为单孢分离法和多孢分离法两 种。 对于异宗结合的食用菌，大都采用多孢分 离法来获得结实性菌种； 单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交 育种等工作。
32
第一节 母种的制作
（二）孢子分离的方法 １．孢子的采集 （整菇插种法 ）
钟罩法采集伞菌类孢子
33
第一节 母种的制作
三角瓶钩悬法
34
菌褶贴附法采集孢子
空气相对湿度保持在60%左右，培养室的湿度 过低时，可适当喷水，湿度过高时，应加强通 风排湿，或向地面洒生石灰吸潮，以防杂菌滋 生污染棉塞或培养基；同时避光并保持空气新 鲜，从而使菌丝生长健壮。
18
第一节 母种的制作
2-3d后，检查菌丝的生长及杂菌污染情况， 若在远离接种块的培养基表面出现独立的小 菌落或奶油状小点，即为污染，应立即淘汰；
30
第一节 母种的制作

发酵菌种的制备

发酵工程
第一章
第二章 第三章
发酵工程总论
发酵设备 发酵工业原料及其处理
发 酵 工 程
第四章
第五章 第六章 第七章 第八章 第九章 第十章 第十一章
发酵工业灭菌
发酵菌种的制备 发酵工业放大 微生物发酵机制 发酵动力学 发酵过程工艺控制 发酵染菌及防治 发酵工业废物、废水处理和资源化技术
第十二章 展望
发酵工程
已工业化产品生产菌的介绍
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。 关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆 菌和地衣牙孢杆菌
1.3 工业生产常用的微生物菌种
1.4 工业微生物菌种的分离
一、菌种分离的一般过程 样品采集
→
预处理 → 增殖培养 → 纯培养
→ 菌种的鉴定 → 生产性能测定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物
复合酶系
问题：如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现 复合菌系
1.4 工业微生物菌种的分离
二、采样时要注意的问题
1.6 菌种的退化与保藏
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点
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1.4 工业微生物菌种的分离
一、菌种分离的一般过程 样品采集
→
预处理 → 增殖培养 → 纯培养
→ 菌种的鉴定 → 生产性能测定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题：如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现
1.4 工业微生物菌种的分离
二、采样时要注意的问题
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
五、目的微生物富集方法的研究进展
目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%，微生物的
多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。
陈文新（科学院院士） ， 2002
分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物
的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等
称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶
HT:高丝氨酸转乙酰酶
黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸 的合成调节机制
1.3 工业生产常用的微生物菌种
二、氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚，简单 谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌 其他氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
中菌种是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良
性能而考虑和设计的。 能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它 们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能 力强、易变异改造等特点。
1.2 发酵工业对菌种的要求
1) 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且 产量高； 2）培养条件易于控制；
一、自然选育
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9。 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰 退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突 变成为正突变。
1.5 发酵高产菌种的选育
自然选育在工业生产上的意义
DNA shuffling
图1
有性PCR法改组DNA的基本程序
DNA shuffling
图2 交错延伸法改组DNA的基本程序
发酵工程
DNA shuffling
Fragment with DNAseI
X X XX X XXX XX X
Reassemble fragments
XXX X
Select best recombinants
定 点 突 变
错位PCR
DNA改组(DNA Shuffling): 指DNA分子的体外重排，是基
因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。 DNA改组技术(1994)的发明人Stemmer博士，他以5项美国专利为 技术支撑点，于1997年创立了专门从事DNA改组研究的公司
问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。
1.5 发酵高产菌种的选育
自然选育操作步骤：
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板划线法 平板稀释法 平板分离 挑选单菌落 发酵试验 选择性培养法 随机分离法 注意形态的观察
1.5 发酵高产菌种的选育
二、诱变育种
用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选， 称为诱变育种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 （P103） 物理：紫外，快中子，射线，激光 诱变剂 化学：硫酸二乙酯（DES），亚硝基胍（NTG） 生物：噬菌体，转座子
二、诱变育种
（一）、诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染 色体畸变和基因突变两大类。
已工业化产品生产菌的介绍
三、常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
发酵工程
1.3 工业生产常用的微生物菌种
地球上的微生物资源非常丰富，
目前已发现的仅占其总数的1%~5%，
而在工业生产中被利用的仅有数百种，
分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、
担子菌、藻类。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
3）生长速度快，发酵周期短；
4）满足代谢控制的要求； 5）抗噬菌体和杂菌的能力强；
6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化；
7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、 降低成本有重要意义；
8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳 源利用；
9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生 物活性物质和毒素，以保证安全。
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。 富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件，进行培养。 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，
不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这
诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到 达到高产菌株。
二、诱变育种
（三）、诱变育种的一般步骤
出发菌株的选择
自然界直接分离到的野生型菌株
经历过生产条件考验的菌株 已经历多次育种处理的菌株
制备菌悬液
诱变处理
营养缺陷型突变菌株的筛选 抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株 的筛选 组成型突变株的筛选 抗性突变株的筛选
Maxygen。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈
并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司 duPont公司、 生产抗生素的世界巨头 DSM公司和工业酶研究生产之最的Novo nordisk公司。此外，迄今为止，Maxygen公司还得到了来自美国 国防高级研究计划局(DARPA)和国家科学技术协会(NIST)的5项 资助，共计2100万美元。从另一角度反映了DNA改组的重要性及 美国政府及商家对DNA改组技术的重视程度。
（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择
压硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
二、诱变育种 （三）、诱变育种的一般步骤 （P103） 诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分。
诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱 变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。 筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能 力。
三、基因的直接进化(directed evolution)
在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过 高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。
步骤：
突变
基因突变库的建立
筛选
基因突变库的筛选
基因复制与遗传
主要应用：
酶活性能的提高: 生理环境→工业催化环境
底物专一性
pH
温度 有机溶剂
1 发酵工业微生物菌种的选育
2 发酵工业微生物
第五章 发酵菌种的制备
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点 1.2 发酵工业对菌种的要求 1.3 工业生产常用的微生物菌种 1.4 工业微生物菌种的分离 1.5 发酵高产菌种的选育
1 发酵工业微生物菌种的选育
1.1 工业微生物的特点
一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种、 合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制，其
(二) 真核细胞表达系统
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
时只能通过随机分离的办法
1.4 工业微生物菌种的分离
三、目的微生物富集的一些基本方法
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等，
但主要是通过培养的方法
三、目的微生物富集的一些基本方法
定向培养的富集方法
1、底物 3、培养时间 2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度 的手段，培养（固体、液体；分批、连 续）后使目的微生物在种群中占优势。
1.5 发酵高产菌种的选育
目的
防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量
开发新产品
1.5 发酵高产菌种的选育
方法
基因突变： 自然选育、诱变育种 基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化： 点突变、易位PCR、同序法
DNA Shuffling等
1.5 发酵高产菌种的选育
1.3 工业生产常用的微生物菌种
已工业化产品生产菌的介绍
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？