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姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
核酶的作用机制
核酶的作用机制是指核酶在催化反应中如何发挥作用的过程。
核酶是一种具有催化功能的RNA分子，通过与底物RNA的特异性结合，在RNA链内部或特定区域进行切割和修饰，从而调控基因的表达。
核酶的作用机制通常包括以下几个步骤：
识别与结合：核酶首先需要识别并结合到特定的底物RNA上，这是催化反应的第一步。
核酶与底物RNA的结合通常具有很高的特异性，保证了反应的准确性。
切割与修饰：结合后的核酶通过催化作用对底物RNA进行切割或修饰。
具体反应机制取决于核酶的种类。
有些核酶仅对底物RNA进行切割，有些则可以催化多种不同类型的反应，如磷酸化、腺苷化等。
产物释放：反应完成后，核酶从底物RNA上释放出来，完成整个催化过程。
这一步通常需要特定的离子或分子参与，以确保反应的顺利进行。
核酶的作用机制非常复杂，涉及多个因素的综合作用。
例如，核酶的构象变化、底物RNA的序列和结构、环境因素等都会对催化反应产生影响。
因此，深入了解核酶的作用机制有助于更好地理解其生物学功能，并为未来的生物技术应用提供新的思路和途径。
我是核酸，也是酶——DNAzyme核酶简介1982年，美国科学家T. Cech在研究中发现了核酶（ribozyme），自身剪接内含子的RNA具有催化功能[1]。
这揭示了酶不仅有蛋白一种组成形式，也有可能是核酸。
无独有偶，Gerald Joyce在1994年发现了脱氧核酶（DNAzyme），可以催化单个核糖核苷酸磷酸酯的Pb2+依赖性切割[2]。
迄今为止已经发现了数十种DNAzyme。
DNAzyme一般是通过SELEX体外筛选技术获得。
下面以RNA切割活性的DNAzyme为例，简单介绍体外筛选的过程。
如图1所示，用于筛选的DNA文库包含一段60个随机碱基的部分（图中绿色部分），两侧是能与PCR产物结合的序列（黑色部分），PCR产物结合序列的上游包含RNA位点，作为DNAzyme的底物。
在文库DNA的5’端修饰有生物素，与链酶亲和素结合从而固定在固相表面。
金属离子存在时，小部分文库DNA序列可以折叠形成带有酶活性的结构，切割RNA位点，这部分文库得以从固相表面释放下来。
切割下来的产物通过两轮PCR进行富集，第一轮PCR扩增全长序列，第二类PCR通过引物再次引入RNA位点和生物素标签。
通过5~10轮的重复直到文库达到饱和。
接下来对文库测序以鉴定出那些活性最高的序列[3]。
图1：RNA切割活性的DNAzyme体外筛选获得的方法核酶的种类根据催化功能的不同，可以将DNAzyme分为5大类：RNA切割活性的DNAzyme、DNA切割活性的DNAzyme，具有连接酶功能的DNAzyme，过氧化物酶活力的DNAzyme，修饰胸腺嘧啶二聚体的DNAzyme[4]。
下面分别介绍这五类DNAzyme。
1. RNA切割活性的DNAzyme这类DNAzyme是发现最早，也是研究的最深入的一类DNAzyme。
比较早被研究的是8-17和10-23两种DNAzyme，它是在1997年由SELEX（指数富集的配基系统进化技术）发现的，命名来源于体外筛选的过程，8-17是筛选过程的第8轮的第17个克隆获得，而10-23是筛选过程的第10轮的第23个克隆获得[5]。
核酶的生物学作用
核酶是一类具有催化活性的RNA分子，它们在生物体内发挥着重要的生物学作用。
核酶的发现和研究不仅丰富了生物化学领域的内容，还为疾病的治疗提供了新的思路。
核酶在基因表达调控中起着关键作用。
RNA干扰（RNAi）是一种广泛存在于生物体内的自然现象，它通过双链RNA诱导同源mRNA的降解，从而抑制基因的表达。
在这个过程中，核酶起到了催化作用，使得RNA干扰成为一种高效的基因沉默手段。
此外，核酶还可以参与其他类型的基因调控，如转录后修饰、翻译调控等。
核酶在细胞信号传导中也发挥着重要作用。
许多信号分子的识别和处理都需要依赖于特定的核酶。
例如，小干扰RNA（siRNA）是一种具有特定序列的RNA分子，它可以与目标mRNA结合，引导核糖核酸酶P（RNase P）对mRNA进行切割，从而抑制基因的表达。
这种机制在生物体的生长发育、免疫应答等过程中具有重要意义。
核酶在疾病治疗方面具有巨大潜力。
由于核酶的高度特异性和催化活性，它们可以作为一种新型的药物靶点，用于治疗各种疾病。
例如，针对某些病毒性疾病，可以通过设计具有特定序列的核酶，使其与病毒基因组结合并切割，从而抑制病毒的复制和传播。
此外，核酶还可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤等疾病。
然而，核酶在临床应用中还面临一些挑战。
首先，核酶的稳定性和生物相容性需要进一步提高，以确保其在体内发挥作用的同时不产生不良反应。
其次，核酶的作用机制和调控网络尚不完全清楚，需要进一步研究以揭示其潜在的应用领域。
核酶的发现与应用
一、核酶的发现
1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。
20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。
1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。
1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度镁离子存在下，与留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶
相同的催化活性。
1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。
1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。
二、核酶的应用
（一）应用于生命起源的研究
体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA 剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。
（二）在医学领域中的应用
1、通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。
2、免疫源性低，很少引起免疫反应。
3、针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
4、用于RNA的修复，核酶、反义核酸和小分子RNA（snRNA）是RNA修复的常用工具。
核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接。
经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子。
5、核酶抗肝炎病毒的研究：目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。
人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。
6、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)核酶。
1998年，美国加利福尼
亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV- Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。
7、抗肿瘤治疗。
核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。
（三）在农业等其他领域的应用
防治动、植物病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等。
