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姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
第八章核酶从人类认识到酶的存在开始到20世纪80年代初，人们一直认为酶的化学本质是蛋白质，这一概念根深蒂固，近似乎成为定论。
然而美国科罗拉多大学博尔分校的Thomas Cech和耶鲁大学的Sidney Altman各自独立发现具有生物催化功能的RNA却从根本上改变了人们的这一认识观念。
1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在没有蛋白质存在的情况下自身催化切除内含子，完成加工过程。
具体事件:1981年Thomas Cech等在研究rRNA前体加工成熟时就发现四膜虫的26rRNA 前体中含有插入序列（IVS），在rRNA前体成熟过程中，IVS通过剪接反应被除去，并证实这一剪接反应不需要任何蛋白质的参与，是四膜虫的基因内区自行拼接的。
1981年,耶鲁大学的Sidney Altman等在从事RNaseP的研究中也发现了这一现象，RNaseP是细菌和高等生物细胞里都有的一种tRNA加工酶，它能在特定的位点上切开tRNA前体。
1983年，就在Thomas Cech等发现RNA能自行拼接后的两年后，Sidney Altman等就证明：在较高的Mg2+浓度下，RNaseP中的RNA（M1RNA）就单独具有催化tRNA前体成熟的功能，而其蛋白质组分却不具备此种催化功能。
根据当时催化剂不仅能加快反应速率，而且在反应前后催化剂本身不发生改变的准确定义，在Thomas Cech等发现四膜虫26SrRNA前体IVS的自身拼接后，科学家们还排斥它作为生物催化剂的资格，认为那是一种自体催化反应，拼接后的成熟rRNA与前体不同，尚不能被看成是严格意义上的催化剂。
Sidney Altman等的发现就从实验上消除了这一异议，原因是RNaseP所催化的反应是一种异体分子间的反应，而该反应正是在RNA的催化下完成的。
此后，1984年R. Lewin在Science 发表的题为“First True RNA Catalyst Found”的报道标志着RNA催化剂的正式诞生。
核酶的发现与应用一、核酶的发现1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。
20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。
1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。
1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度镁离子存在下，与留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶相同的催化活性。
1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。
1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。
二、核酶的应用（一）应用于生命起源的研究体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA 剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。
（二）在医学领域中的应用1、通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。
2、免疫源性低，很少引起免疫反应。
3、针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
4、用于RNA的修复，核酶、反义核酸和小分子RNA（snRNA）是RNA修复的常用工具。
核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接。
经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子。
5、核酶抗肝炎病毒的研究：目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。
我是核酸，也是酶——DNAzyme核酶简介1982年，美国科学家T. Cech在研究中发现了核酶（ribozyme），自身剪接内含子的RNA具有催化功能[1]。
这揭示了酶不仅有蛋白一种组成形式，也有可能是核酸。
无独有偶，Gerald Joyce在1994年发现了脱氧核酶（DNAzyme），可以催化单个核糖核苷酸磷酸酯的Pb2+依赖性切割[2]。
迄今为止已经发现了数十种DNAzyme。
DNAzyme一般是通过SELEX体外筛选技术获得。
下面以RNA切割活性的DNAzyme为例，简单介绍体外筛选的过程。
如图1所示，用于筛选的DNA文库包含一段60个随机碱基的部分（图中绿色部分），两侧是能与PCR产物结合的序列（黑色部分），PCR产物结合序列的上游包含RNA位点，作为DNAzyme的底物。
在文库DNA的5’端修饰有生物素，与链酶亲和素结合从而固定在固相表面。
金属离子存在时，小部分文库DNA序列可以折叠形成带有酶活性的结构，切割RNA位点，这部分文库得以从固相表面释放下来。
切割下来的产物通过两轮PCR进行富集，第一轮PCR扩增全长序列，第二类PCR通过引物再次引入RNA位点和生物素标签。
通过5~10轮的重复直到文库达到饱和。
接下来对文库测序以鉴定出那些活性最高的序列[3]。
图1：RNA切割活性的DNAzyme体外筛选获得的方法核酶的种类根据催化功能的不同，可以将DNAzyme分为5大类：RNA切割活性的DNAzyme、DNA切割活性的DNAzyme，具有连接酶功能的DNAzyme，过氧化物酶活力的DNAzyme，修饰胸腺嘧啶二聚体的DNAzyme[4]。
下面分别介绍这五类DNAzyme。
1. RNA切割活性的DNAzyme这类DNAzyme是发现最早，也是研究的最深入的一类DNAzyme。
比较早被研究的是8-17和10-23两种DNAzyme，它是在1997年由SELEX（指数富集的配基系统进化技术）发现的，命名来源于体外筛选的过程，8-17是筛选过程的第8轮的第17个克隆获得，而10-23是筛选过程的第10轮的第23个克隆获得[5]。
核酶的发现与基本内容什么是核酶核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA 序列。
核酶又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 和S.Altman因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
(内含子：断裂基因的非编码区，可被转录，但在mRNA加工过程中被剪切掉。
前体：修饰加工前，刚刚转录出来的RNA)核酶的特点核酶的功能很多，有的能够切割RNA，有的能够切割DNA，有的还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
大多数核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。
与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。
更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其他的mRNA分子。
核酶的发现与基本内容
什么是核酶
核酶(ribozyme)是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA 序列。
核酶又称核酸类酶、酶RNA、核酶类酶RNA。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
核酶的发现
1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 和S.Altman因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
(内含子：断裂基因的非编码区，可被转录，但在mRNA加工过程中被剪切掉。
前体：修饰加工前，刚刚转录出来的RNA)
核酶的特点
核酶的功能很多，有的能够切割RNA，有的能够切割DNA，有的还具有RNA连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
大多数核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。
与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。
更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其他的mRNA分子。
（反义RNA：与mRNA互补的RNA分子。
由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合，抑制了该mRNA的翻译。
）
核酶的作用
水解作用，即磷酸二酯酶作用
磷酸转移作用，类似磷酸转移酶作用（催化磷酸基团由供体转移到接纳体）。
脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用（在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸）。
RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。
核酸内切酶可以催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键。
有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键，把磷酸基团留在3′位置上，称为5′-内切酶;而有些仅水解3′-磷酸二酯键，把磷酸基团留在5′位置上，称为3′-内切酶。
能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，简称限制酶)。
当外源DNA 侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修。
饰，不被水解，从而得到保护。
限制性核酸内切酶可被分成三种类型。
Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。
Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。
因此，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。
