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核酶的发现与应用一、核酶的发现1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。
20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。
1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。
1983年，Altman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度镁离子存在下，与留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶相同的催化活性。
1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。
核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。
1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖。
二、核酶的应用（一）应用于生命起源的研究体内选择技术的应用已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA 剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。
（二）在医学领域中的应用1、通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。
2、免疫源性低，很少引起免疫反应。
3、针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
4、用于RNA的修复，核酶、反义核酸和小分子RNA（snRNA）是RNA修复的常用工具。
核酶是天然的具有催化能力的RNA分子，能特异性地催化RNA剪接。
经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子。
5、核酶抗肝炎病毒的研究：目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研究。
核酶的作用机制
核酶的作用机制是指核酶在催化反应中如何发挥作用的过程。
核酶是一种具有催化功能的RNA分子，通过与底物RNA的特异性结合，在RNA链内部或特定区域进行切割和修饰，从而调控基因的表达。
核酶的作用机制通常包括以下几个步骤：
识别与结合：核酶首先需要识别并结合到特定的底物RNA上，这是催化反应的第一步。
核酶与底物RNA的结合通常具有很高的特异性，保证了反应的准确性。
切割与修饰：结合后的核酶通过催化作用对底物RNA进行切割或修饰。
具体反应机制取决于核酶的种类。
有些核酶仅对底物RNA进行切割，有些则可以催化多种不同类型的反应，如磷酸化、腺苷化等。
产物释放：反应完成后，核酶从底物RNA上释放出来，完成整个催化过程。
这一步通常需要特定的离子或分子参与，以确保反应的顺利进行。
核酶的作用机制非常复杂，涉及多个因素的综合作用。
例如，核酶的构象变化、底物RNA的序列和结构、环境因素等都会对催化反应产生影响。
因此，深入了解核酶的作用机制有助于更好地理解其生物学功能，并为未来的生物技术应用提供新的思路和途径。
我是核酸，也是酶——DNAzyme核酶简介1982年，美国科学家T. Cech在研究中发现了核酶（ribozyme），自身剪接内含子的RNA具有催化功能[1]。
这揭示了酶不仅有蛋白一种组成形式，也有可能是核酸。
无独有偶，Gerald Joyce在1994年发现了脱氧核酶（DNAzyme），可以催化单个核糖核苷酸磷酸酯的Pb2+依赖性切割[2]。
迄今为止已经发现了数十种DNAzyme。
DNAzyme一般是通过SELEX体外筛选技术获得。
下面以RNA切割活性的DNAzyme为例，简单介绍体外筛选的过程。
如图1所示，用于筛选的DNA文库包含一段60个随机碱基的部分（图中绿色部分），两侧是能与PCR产物结合的序列（黑色部分），PCR产物结合序列的上游包含RNA位点，作为DNAzyme的底物。
在文库DNA的5’端修饰有生物素，与链酶亲和素结合从而固定在固相表面。
金属离子存在时，小部分文库DNA序列可以折叠形成带有酶活性的结构，切割RNA位点，这部分文库得以从固相表面释放下来。
切割下来的产物通过两轮PCR进行富集，第一轮PCR扩增全长序列，第二类PCR通过引物再次引入RNA位点和生物素标签。
通过5~10轮的重复直到文库达到饱和。
接下来对文库测序以鉴定出那些活性最高的序列[3]。
图1：RNA切割活性的DNAzyme体外筛选获得的方法核酶的种类根据催化功能的不同，可以将DNAzyme分为5大类：RNA切割活性的DNAzyme、DNA切割活性的DNAzyme，具有连接酶功能的DNAzyme，过氧化物酶活力的DNAzyme，修饰胸腺嘧啶二聚体的DNAzyme[4]。
下面分别介绍这五类DNAzyme。
1. RNA切割活性的DNAzyme这类DNAzyme是发现最早，也是研究的最深入的一类DNAzyme。
比较早被研究的是8-17和10-23两种DNAzyme，它是在1997年由SELEX（指数富集的配基系统进化技术）发现的，命名来源于体外筛选的过程，8-17是筛选过程的第8轮的第17个克隆获得，而10-23是筛选过程的第10轮的第23个克隆获得[5]。
核酶的生物学作用
核酶是一类具有催化活性的RNA分子，它们在生物体内发挥着重要的生物学作用。
核酶的发现和研究不仅丰富了生物化学领域的内容，还为疾病的治疗提供了新的思路。
核酶在基因表达调控中起着关键作用。
RNA干扰（RNAi）是一种广泛存在于生物体内的自然现象，它通过双链RNA诱导同源mRNA的降解，从而抑制基因的表达。
在这个过程中，核酶起到了催化作用，使得RNA干扰成为一种高效的基因沉默手段。
此外，核酶还可以参与其他类型的基因调控，如转录后修饰、翻译调控等。
核酶在细胞信号传导中也发挥着重要作用。
许多信号分子的识别和处理都需要依赖于特定的核酶。
例如，小干扰RNA（siRNA）是一种具有特定序列的RNA分子，它可以与目标mRNA结合，引导核糖核酸酶P（RNase P）对mRNA进行切割，从而抑制基因的表达。
这种机制在生物体的生长发育、免疫应答等过程中具有重要意义。
核酶在疾病治疗方面具有巨大潜力。
由于核酶的高度特异性和催化活性，它们可以作为一种新型的药物靶点，用于治疗各种疾病。
例如，针对某些病毒性疾病，可以通过设计具有特定序列的核酶，使其与病毒基因组结合并切割，从而抑制病毒的复制和传播。
此外，核酶还可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤等疾病。
然而，核酶在临床应用中还面临一些挑战。
首先，核酶的稳定性和生物相容性需要进一步提高，以确保其在体内发挥作用的同时不产生不良反应。
其次，核酶的作用机制和调控网络尚不完全清楚，需要进一步研究以揭示其潜在的应用领域。
姓名：乔艳红学号：**********年级：2010级班级：一班学院：生命科学学院时间：2011年11月9日核酶的发现与应用一、核酶的发现1981年，Thomas Cech和他的同事在研究四膜虫的26S rRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26S rRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26S rRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。
为了证明这一发现，他们将编码26S rRNA前体DNA克隆到细菌中并且在无细胞系统中转录成26S rRNA前体分子。
结果发现这种人工制备的26S rRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。
这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。
这一发现之后不久，在酵母和真菌的线粒体mRNA和tRNA前体加工、叶绿体的tRNA 和rRNA前体加工、某些细菌病毒的mRNA前体加工中都发现了自我剪接现象。
Thomas Cech 因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。
核酶的发现在生命科学中具有重要意义，在进化上使我们有理由推测早期遗传信息和遗传信息功能体现者是一体的，只是在进化的某一进程中蛋白质和核酸分别执行不同的功能。
核酶的发现为临床的基因治疗提供了一种手段，具有重要的应用前景。
二、核酶的概念核酶一词用于描述具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。
核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。
核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。
U pA G pU 5'3'5'外显子3'外显子内含子三、核酶的分类剪接型（ splicing ）核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性。
、作用机制：通过既剪又接的方式除去内含子 （Intron)。
需要鸟苷酸或鸟苷及镁离子参与剪接机制：I 型内含子的结构特点： 1、拼接点序列为5’U... (3)2、中部核心结构3、内部引导序列4、剪接通过转酯反应进行剪切型（cleavage ）核酶：这类核酶催化自身或者异体RNA 的切割，相当于核酸内切酶。
这类RNA 进行催化反应时只切不接。
类型：1) 自体催化剪切型 2) 异体催化剪切型。
特点：在 Mg 2+ 或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5‘-OH 和2’, 3‘-环磷酸二酯末端。
剪 切 机 制：四、核酶的应用核酶是在对多种植物病毒卫星RNA 及类病毒RNA 的自我剪接研究中 发现的，数量pGpA G pU 3'U 5'OH 第一次转酯反应第二次转酯反应U 5'pU 3'pGpA GOH 5'3'较少，常见于rRNA的内含子。
核酶的具体作用主要有：核苷酸转移作用。
水解反应，即磷酸二酯酶作用。
磷酸转移反应，类似磷酸转移酶作用。
脱磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。
RNA内切反应，即RNA限制性内切酶作用。
核酸内切酶可以催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯核酶键。
有些核酸内切酶仅水解5′磷酸二酯键，把磷仅水解3′-磷酸二酯键，把磷酸基团留在5′位置上，称为3′-内切酶。
能专一性地识别并水解双链DNA上的特异核苷酸顺序，称为限制性核酸内切酶（restr iction endonuclease，简称限制酶）。
当外源DNA侵入细菌后，限制性内切酶可将其水解切成片段，从而限制了外源DNA在细菌细胞内的表达，而细菌本身的DNA由于在该特异核苷酸顺序处被甲基化酶修饰，不被水解，从而得到保护。
限制性核酸内切酶可被分成三种类型。
Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗A TP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。
Ⅱ型限制酶水解DNA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修饰DNA，能在所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA。
因此，被广泛用于DNA分子克隆和序列测定。
四、核酶的具体应用实例(一) 抗病治疗随着对核酶的深入研究，已经认识到核酶在遗传病，肿瘤和病毒性疾病上的潜力。
比如，对于艾滋病毒HIV的转录信息来源于RNA而非DNA，核酶能够在特定位点切断RNA，使得它失去活性。
如果一个能专一识别HIV的RNA的核酶存在于被病毒感染的细胞内，那么它就能建立抵抗入侵的第一防线。
甚至，HIV确实进入到了细胞并进行了复制，RNA也可以在病毒生活史的不同阶段切断HIV的RNA而不影响自身的RNA。
又如，白血病是造血系统的恶性肿瘤,目前尚缺少有效的治疗方法。
核酶的发现，尤其是锤头状核酶，为白血病的核酶基因治疗带来了新的希望。
近些年，在国外的一些国家已经在小白鼠体内得到较好的效果。
（二）反义核酸技术反义核酸反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或D NA分子。
利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术[1-3]。
它包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)三大技术。
反义核酶作为一种基因下向调节作用因子，在抑制一些有害基因的表达和失控基因的过度表达上发挥着重要作用。
随着反义核酶技术的发展和成熟，已逐渐应用于抗某些人体寄生虫病的研究。
作用原理反义核酸目前有三种来源：一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，这是反义核酸最普遍的应用方式，包括未修饰AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修饰AON二类，其中以PSAON应用最广泛。
ANO设计合成简单，只要其顺序与靶mRNA部分顺序互补即可，而对基因的读码框无要求；二是更具有实用价值的工人表达载体，包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体[3]，它是利用基因重组技术将靶基因序列反向持插入到载体的启动子和终止子之间，通过转录可源源不断产生反义RNA分子；三是天然存在的反义核酸分子，但目前分离纯化尚存在困难。
作用特点反义核酸作为基因治疗药物之一，与传统药物相比具有诸多优点。
1)高度特异性：反义核酸药物通过特异的碱基互补配对作用于靶RNA或DNA，犹如“生物导弹”。
2)高生物活性、丰富的信息量；反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体，碱基排列顺序可千变万化，不可穷尽。
3)高效性：直接阻止疾病基因的转录和翻译。
4)最优化的药物设计：反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息，实际上是最合理的药物设计。
5)低毒、安全：反义核酸尚未发现其有显著毒性，尽管其在生物体内的存留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性。
反义核酸技术反义核酸技术是20世纪70年代末发展起来的系统应用新技术，在人类基因组计划取得成果的基础上得到了快速发展。
反义核酸化妆品是在生物技术药物研究的基础上最新发展起来的，与传统化妆品相比，具有高效、高选择性、安全环保的特点。
反义核酸技术在化妆品领域异军突起，代表了化妆品发展的一个重要方向。
反义技术是应用碱基配对的原理，以体内表达某种特定蛋白质的靶基因为基础，人工设计一段与之互补的基因片段封闭该靶基因，直接阻断该蛋白质的产生。
针对有害基因，突变基因，非正常基因及其过度表达的基因，科学家设计了反义核酸，使这些基因关闭或者低表达。
反义核酸是人工合成的D NA片段（简称寡核苷酸），它与待封闭基因的某一区段互补，能够抑制或封闭靶细胞基因的表达。
由于它与基因序列（称为正义链）碱基互补，或者说具有某种意义上的“镜象”关系，因此，这类寡核苷酸称为“反义核酸”。
自1978年反义核酸概念提出，到1998年10月第一个反义核酸药物在美国问世，标志着反义核酸理论已趋于成熟。
人类基因组计划的进展为反义核酸技术的发展奠定了坚实基础。
近年来，国际著名的大型制药公司纷纷以各种方式介入反义技术研究，并且有多个反义核酸药物进入三期临床试验，这些都表明反义核酸技术及其产品的发展前景十分广阔。
反义核酸技术在药物研究方面的发展日臻成熟，随着基因组学的发展，在其他方面的应用也开始受到关注。
包括农业育种、功能基因研究、化妆品等方面都已经有了成功应用的例子。
反义核酸在应用领域不断扩展，同时其生产技术也在不断发展，反义序列筛选技术、寡核苷酸合成纯化技术逐步完善，并已有专业公司提供商业化服务，作为基因功能研究的工具已实现商业化，合成成本不断下降，促进了反义核酸产业的高速发展。
反义技术是继基因克隆和重组技术之后在分子生物学领域中兴起的一门全新的基因工程技术。
采用反义技术开发新的生物医学美容产品，使生物医学美容从生理上完成人体的延缓衰老、抗皱、去痘、美白与健康，已经成为高科技化妆品研究的一个热点。
与疾病的产生原因相同，人体美的外在表现同样离不开基因。
基因通过其表达产物——蛋白质调节人体各种生理和生化过程，从而产生影响人体美的结果。
应用反义核酸技术筛选出表达影响人体美的蛋白质基因，设计一段与之互补的反义片段，将其封闭，从源头上抑核酶制这种蛋白质的产生，借此达到美容效果。
目前，国外已有多个化妆品产品应用了反义技术，包括Christian Dior、日本SK-II、朗斯国际等，国内进行反义技术化妆品开发的企业还很少。
反义核酸技术系统应用于化妆品开发的特点设计简单——根据碱基互补原理，只要知道某种美损性皮肤问题的靶基因序列，就可设计相应的反义核酸DNA，进行系列化妆品产品的开发。
特异性高——反义核酸通常为20个碱基左右的寡核苷酸，它通过多点与靶基因结合，因而具有非常高的特异性。
靶点丰富——人类基因组计划研究成果为反义技术提供了丰富的靶点，可以不断开发出新的美容产品。
反义核酸技术化妆品的特点与传统化妆品相比，反义核酸技术化妆品突破了传统化妆品的界限。
安全性——反义核酸DNA与人皮肤亲和性和同源性高，对人体皮肤不产生毒、副作用。
参与皮肤细胞的生命活动——反义核酸化妆品直接参与人体皮肤细胞的生命活动，阻断致病mRNA翻译为致病蛋白质的过程，从本质上改善皮肤质量，达到美容目的。
而传统产品是利用化学物质的腐蚀遮盖或物理摩擦作用，对人体皮肤进行外部侵蚀和剥离，其中的重金属（铅、汞等）经皮肤细胞吸收后，皮肤会因中毒而逐渐遭到破坏，从而也加快了皮肤衰老。
促进健康基因生长，达到综合美容效果——明确了与美容相关的功能基因后，利用反义技术，对功能基因进行正向或负向调控，使皮肤细胞达到健康平衡的良好生理水平，达到综合美容效果。
