两类猪ADP-核糖基化因子的克隆分析
- 格式：doc
- 大小：754.66 KB
- 文档页数：11
哺乳动物小G结合蛋白——二磷酸腺苷-核糖基化因子（ADP-ribosylation factors, Arfs）除在囊泡运输、细胞骨架重排和调节细胞吞噬等方面起重要作用外，还与病毒的感染有关。
前期研究发现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 感染早期ARFs基因表达明显上调，然而在猪只中ARFs与PRRSV的感染至今知之甚少。
目前研究中，猪ARF1和ARF4分别被克隆，序列分析发现：ARF1包含一个长度为546 bp的开放阅读框(Open reading frame, ORF)，预测编码181个氨基酸，理论分子质量为20.70kDa，pI为6.62；ARF4包含一个长度为543 bp的开放阅读框，预测编码180个氨基酸，理论分子质量为20.50kDa，pI为5.46。
蛋白序列结构分析显示猪ARF1和ARF4蛋白含有典型的ploop、switch区、interswitch区和N端疏水区的Hasp，在第二位都含有可被肉豆蔻酰基化的甘氨酸。
猪ARF1和ARF4的原核表达载体也被构建，为进一步研究其在PRRSV感染过程中的调控提供基础。
关键词：ARF1，ARF4，原核表达，PRRSV，猪Molecular Cloning of Two ADP Ribosylation Factors and Construction of their 0Prokaryotic Expression Vector in Sus sacrofaAbstractADP-ribosylation factors (Arfs) that play an essential role in intracellular trafficking, remodeling of the cytoskeleton and mediating phagocytosis are small GTP-binding protein, which have been identified recently to be involved in virus infection. The results of our lab indicated expression of ARFs gene of pig was up-regulated in early infection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). However, little is known about their relationships with PRRSV infection in pig to date. In the present study, ARF1 and ARF4 gene were cloned from the pig Sus sacrofa. Sequences analysis showed ARF1 gene contains a length of 546 bp of ORF, which encodes a predicted protein of 181 deduced amino acids with a calculated molecular weight of 20.70kDa and a pI of 6.62. For ARF4, the corresponding parameters were 543 bp, 180 deduced amino acids, 20.50 kDa and 5.46, respectively. The predicted structure indicated that ARF1 and ARF4 possessed the property of Arfs, including the site of myristoylation at position 2, p loop, switch1, switch2 and interswitch regions and N-terminal Hasp. To provide a basis for the future research of their functions during infection of PRRSV, the prokaryotic expression vector of ARF1 and ARF4 were constructed.Key words: ARF1, ARF4, prokaryotic expression, PRRSV, Sus sacrofa目录前言 (1)1 材料与方法 (2)1.1 试剂与设备 (2)1.1.1 常用试剂 (2)1.1.2 主要设备 (2)1.2 材料 (2)1.3引物设计 (2)1.4 方法 (2)1.4.1 猪ARF1和ARF4基因扩增 (2)1.4.1.1 组织总RNA提取 (2)1.4.1.2 cDNA合成 (3)1.4.1.3 ARF1和ARF4基因扩增 (3)1.4.2 基因扩增产物的回收、连接和测序 (3)1.4.3 序列分析 (3)1.4.4 猪ARF1、ARF4融合蛋白原核表达载体构建 (3)1.4.4.1 ARF1、ARF4基因表达序列的扩增 (3)1.4.4.2 扩增的ARF1、ARF4序列和表达载体酶切及回收 (4)1.4.4.3 表达载体和目的片段连接、转化及检测 (4)2 结果 (4)2.1 猪ARF1、ARF4基因ORF的克隆与分析 (4)2.1.1 猪ARF1、ARF4基因ORF的克隆 (4)2.1.2 猪ARF1、ARF4基因ORF序列及蛋白结构特征 (4)2.2 猪ARF1、ARF4融合蛋白原核表达载体构建 (5)3 讨论 (6)4 结论 (6)参考文献 (7)致谢.......................................................................................... 错误！未定义书签。
2前言生猪养殖和猪肉产品加工是我国的重要产业之一，但长期制约该产业迅速发展的主要因素是一些重要猪病的爆发，尤其是2006年以来高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV）引起的高热病的爆发使养猪业遭受重大损失，因此，了解病毒的感染特性和做好猪只的免疫预防工作是养殖过程中首要解决的问题。
目前，对于PRRSV免疫预防研究工作已经取得了一些进展[1-2]，但对病毒入侵宿主细胞过程中其膜及细胞质中的小G蛋白调控的囊泡运输知之甚少，尤其在参与PRRSV的复制或参与病毒防御等方面还未见报道。
细胞内物质运输对细胞的生存和生长至关重要，它能促进细胞内亚单位膜等的形成，使细胞能够分泌特定物质如激素和神经递质等并通过胞吞作用摄取外源分子。
真核细胞大分子囊泡运输受多种调节分子控制，其中ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factors, Arfs）就是其中重要的因子之一[3]。
Arfs属于小G蛋白Ras家族，最初的命名是根据它能作为霍乱毒素催化GS蛋白ADP核糖基化反应的辅助因子，在N端的第二位（通常为氨基酸G）发生肉豆蔻酰基化命名的[4]。
ARF广泛存在于各类物种中，已经从人、老鼠、鸡、果蝇、酵母以及植物中分离出ARF的基因，基因的表达情况也随之展开。
人们利用哺乳动物ARF1-6的特异探针同脑、心、肺、肝、脾、肾等组织及培养的细胞进行杂交，结果所有被检测组织和细胞中都有强的杂交信号[5-6]。
发现ARF参与高尔基体的生理功能最早是在酵母中发现的，ARF在细胞内控制高尔基体囊泡的形成，是囊泡转运途径的关键成分[7]。
在从内质网向高尔基体的囊泡转运过程中，ARF需要还外被蛋白结合形成复合囊泡[8]。
研究还发现，Arfs在细胞囊泡运输、磷脂代谢、细胞骨架重组及调节细胞吞噬等方面起重要作用[9-10]，近期报道哺乳动物的一些ARF 成员与病毒的感染有关[11-12]，因此，猪ARFs与PRRSV的感染或抑制该病毒的复制的关系等值得进一步探索。
研究前期工作中，我们发现PRRSV感染早期猪ARFs表达量显著上调，本文从已报道的猪小G蛋白序列克隆了ARF1和ARF4基因，分析了两个基因的蛋白结构特征。
同时，构建该两个基因的原核表达载体以获得抗血清，为进一步研究他们在PRRSV感染过程中的调控作用提供理论基础。
11 材料与方法1.1 试剂与设备1.1.1 常用试剂限制性内切酶BamH I与EcoRⅠ(Takara)、反转录酶M-MLV(Takara)、ExTaq DNA聚合酶(Takara)、PMD18-T载体(Takara)、T4 Ligase(Takara)、DL2000 marker(Takara)、质粒提取试剂盒(Omega)、DNA回收试剂盒(Omega)、100 bp marker (Tiangen) 购于郑州久是生物有限责任公司；琼脂糖、蛋白胨和酵母浸出膏等购自上海生物工程技术有限公司；枪头和离心管(Axygen)购于北京鼎国生物工程公司；其他常用试剂均为国产分析纯试剂；PGEX-4T-2载体和大肠杆菌(Escherichia coli Top10) 由本实验室保藏。
1.1.2 主要设备PCR仪，凝胶成像系统，水平电泳槽，电泳仪，超净工作台，台式冷冻离心机，隔水式恒温培养箱，恒温摇床，电子精密天平，高压灭菌锅，制冰机等。
1.2 材料从动物科学学院兽医院取疑似PRRSV感染的杜洛克猪肺、脑等少量组织，液氮冻存带回实验室处理。
1.3引物设计根据NCBI (National Center for Biotechnology Information) 猪ARF1 (EU850395) 序列设计扩增ARF1全长ORF引物(Sarf1F: CAGCATGGG- GAATATCTTTGC和Sarf1R: CTCACTTCTGGTTCCGGAGC)和原核表达引物(Sarf1F1: CCGGATCCATGGGGAATATCTTTGC和Sarf1R1：GCGAATTCTCA- CTTCTGGTTCCGGAGC)；猪ARF4 (NM_001048072) 序列设计扩增ARF4全长ORF引物(Sarf4F: TTACCGCCATGGGCCTCAC和Sarf4R: ACATCCAGTTTC- ATTTAACGTTTTG)和原核表达引物(Sarf4F1: CCGGATCCATGGGCCT- CACCATCTCC和Sarf4R1：CGAATTCCAGTTTCATTTAACGTTTTG)，上海生工合成，下划线为酶切位点。
