食品微生物之检验方法－阪崎肠杆菌之检验1 适用范围：本方法适用于一般食品及奶粉中阪崎肠杆菌之检验。
2 检验方法：2.1 工作环境：工作平台须宽敞、洁净、光线良好，操作平台光度为100呎烛光以上，密闭室内换气良好，尽可能没有灰尘及流动空气。
每15分钟落菌数不得超过15 CFU／培养皿。
2.2 器具及材料：2.2.1 干热灭菌器。
2.2.2 高压灭菌釜。
2.2.3 搅拌均质器（Blender）或铁胃（Stomacher）：适用于无菌操作者。
2.2.4 天平：可称量到2000 g者，灵敏度为0.1 g；可称量到120 g者，灵敏度为1 mg。
2.2.5 冰箱：能维持5 ± 3℃者。
2.2.6 吸管或吸管尖：已灭菌，1 mL吸管应有0.01 mL之刻度；5 mL及10 mL吸管应有0.1 mL 之刻度。
2.2.7 吸管辅助器（Pipette aid）或微量分注器。
2.2.8 稀释瓶：160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、铁弗龙（Teflon）或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质，附螺旋盖。
2.2.9 培养皿：已灭菌，内径约9 cm，深度约15 mm，底皿之内外面应平坦，无气泡、刮伤或其它缺点。
2.2.10 增菌用容器：附螺旋盖之125 mL、250 mL、2 L三角锥瓶或广口瓶；玻璃、聚乙烯、铁弗龙或其它能耐121℃湿热灭菌20分钟以上之塑料材质。
2.2.11 pH测定仪。
2.2.12 培养箱：能维持内部温度在± 1℃以内者。
2.2.13 温度计：量测温度范围1～55℃，最小刻度0.1℃。
2.2.14 水浴：加盖，具水流循环系统，能维持水温温差在± 0.2℃以内者。
2.2.15 接种针及接种环（直径约3 mm）：镍铬合金、铂铱或铬线材质，或可抛弃式者。
2.2.16 曲玻棒：可灭菌者，直径3～4 mm，涂抹区域45～55 mm。
2.2.17 试管：10 × 100 mm，13 × 100 mm，13 × 120 mm，15 × 150 mm，16 × 150 mm试管，或其它适用者。
2.2.18 旋涡混合器（Vortex mixer）。
2.2.19 显微镜：能放大至1000倍以上之一般光学显微镜。
2.2.20 载玻片及盖玻片：适用于染色及镜检用。
2.2.21 研钵、杵。
2.2.22 药勺、剪刀、小刀、镊子：可灭菌。
2.2.23 滤纸及褐色试药瓶。
2.2.24 无菌滤膜：孔径0.45 μm或以下之亲水性醋酸纤维膜。
2.2.25 杜兰发酵管（Durham fermentation tube）：外径9 × 22 mm或其它适用者。
2.2.26 试药：氯化钠、硫酸月桂酸钠（sodium lauryl sulfate）、胆盐No. 3（bile salts No. 3）、中性红（neutral red）、结晶紫（crystal violet）、柠檬酸铁铵（ferric ammonium citrate）、脱氧胆酸钠（sodium desoxycholate）、硫代硫酸钠（sodium thiosulfate）、草酸铵（ammoniumoxalate）、碘化钾、碘、沙黄O（safranin O）、对-二甲胺基苯甲醛（p-dimethyl aminobenzaldehyde）、四甲基对位苯二胺盐酸盐（N,N,N',N'-tetramethyl -ρ-phenylenediamine‧2HCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4‧H2O）、硝基苯哌喃半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside）、亮绿（brilliant green）、酚红（phenol red）、溴甲酚紫（bromcresol purple）、溴麝香草蓝（bromthymol blue）、肌酸（creatine）、甲基红（methyl red）、α-萘酚（α-naphthol）、氢氧化钾、95%乙醇、无水乙醇、戊醇（amyl alcohol）或异戊醇（isoamyl alcohol）、乳糖、蔗糖、半乳糖醇（dulcitol）、核糖醇（adonitol）、棉子糖（raffinose）、山梨醇（sorbitol）、阿拉伯糖醇（D-arabitol）、氰化钾、氢氧化钠、L-离胺酸（L-lysine）、L-鸟胺酸（L-ornithine）、L-精胺酸（L-arginine）、矿物油或液态石蜡油（paraffin oil）及盐酸等均采用化学试药级。
2.2.27 试剂：2.2.27.1 无菌蒸馏水：蒸馏水900 mL、90 mL、9 mL，分装于增菌容器或试管中，以121℃灭菌15分钟。
2.2.27.2 0.85%生理食盐水：取氯化钠8.5 g溶于1000 mL蒸馏水中，分装于试管内，以121℃灭菌15分钟。
2.2.27.3 柯瓦克氏试剂（Kovacs’ reagent）：取对-二甲胺基苯甲醛5 g溶于戊醇或异戊醇75 mL中，再徐徐加入盐酸25 mL，混合均匀后应呈黄色并须保存于4℃冰箱中。
2.2.27.4 甲基红指示剂（Methyl red indicator）：取甲基红0.1 g溶于95%乙醇300 mL后，再加蒸馏水使成500 mL。
2.2.27.5 欧普氏试剂（Voges-Proskauer test reagents, VP reagents）：溶液A：取α-萘酚5 g溶于无水乙醇100 mL中。
溶液B：取氢氧化钾40 g溶于蒸馏水中，并使成100 mL。
2.2.27.6 0.5%氰化钾溶液（0.5% potassium cyanide solution）：取氰化钾0.5 g溶于无菌蒸馏水100 mL中（氰化钾为剧毒物质，本操作务必在抽气柜内进行）。
2.2.27.7 矿物油或液态石蜡油：取矿物油或液态石蜡油20～50 mL，装入有盖容器中约1/2满，以121℃灭菌30分钟。
2.2.27.8 革兰氏染色液（Gram stain solution）：2.2.27.8.1 哈克氏（Hucker’s）结晶紫液（初染剂）：溶液A：取结晶紫2 g溶于95%乙醇20 mL中。
溶液B：取草酸铵0.8 g溶于蒸馏水80 mL中。
将溶液A与溶液B混合，静置24小时后以滤纸过滤，取滤液作为初染剂。
2.2.27.8.2 革兰氏碘液（媒染剂）：取碘化钾2 g及碘1 g置于研砵中，经研磨5～10秒钟后，加蒸馏水1 mL研磨，次加蒸馏水5 mL研磨，再加蒸馏水10 mL，研磨至碘化钾和碘完全溶于水中，将此溶液注入褐色瓶中，再以适量蒸馏水洗涤研砵及杵后，并入洗液，加蒸馏水使成300 mL。
2.2.27.8.3 哈克氏复染液（复染剂）：取沙黄O 2.5 g溶于95%乙醇100 mL中，供作复染原液。
使用时，取原液10 mL加蒸馏水90 mL，作为复染液。
注：革兰氏染色液因放久可能失效，因此若购买成品时，要注意其保存期限，若自行配制者应检查其染色效果。
2.2.27.9 氧化酶试剂（Oxidase reagent）：取四甲基对位苯二胺盐酸盐1 g溶于蒸馏水100 mL后，贮存于褐色瓶，并置入冰箱中，使用期限以不超过1星期为宜。
2.2.27.10 1 M磷酸二氢钠溶液：取磷酸二氢钠6.9 g溶于蒸馏水45 mL中，徐徐注入30%氢氧化钠溶液约3 mL，调整pH值为7.0，续加入蒸馏水使成50 mL，贮存于4℃冰箱中备用。
2.2.27.11 硝基苯哌喃半乳糖试剂（ONPG reagent）：取硝基苯哌喃半乳糖80 mg溶于37℃蒸馏水15 mL中，再加入1 M磷酸二氢钠溶液5 mL，即为0.0133 M硝基苯哌喃半乳糖试剂，贮存于4℃冰箱中，使用时须加温至37℃。
2.2.28 培养基：2.2.28.1 蛋白胨缓冲液（Buffered peptone water, BPW）蛋白胨（peptone）10 g氯化钠（NaCl） 5 g磷酸氢二钠（Na2HPO4） 3.5 g磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5 g蒸馏水1000 mL搅拌加热溶解后，以121℃灭菌15分钟，最终pH值为7.2 ± 0.2。
2.2.28.2 加盐硫酸月桂酸胰化蛋白培养液（Lauryl tryptose broth with 2% NaCl, 2% NaCl-LST）胰化蛋白（tryptose）20 g乳糖（lactose） 5 g磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g氯化钠（NaCl）20 g硫酸月桂酸钠（sodium lauryl sulfate）0.1 g蒸馏水1000 mL加热溶解后，分取10 mL注入装有杜兰发酵管之试管内，以121℃灭菌15分钟，最终pH值为6.8 ±0.2。
2.2.28.3 紫红胆盐葡萄糖培养基（Violet red bile glucose agar, VRBG）酵母抽出液（yeast extract） 3 g蛋白胨（peptone）7 g氯化钠（NaCl） 5 g胆盐No. 3（bile salts No. 3） 1.5 g乳糖（lactose） 10 g中性红（neutral red）0.03 g结晶紫（crystal violet）0.002 g洋菜（agar）15 g葡萄糖（glucose）10 g蒸馏水1000 mL加热至沸腾溶解，注意不可加热过度。
于45～50℃水浴中冷却，最终pH值为7.4 ± 0.2。
每培养皿注入约20 mL，凝固后确定表面干燥后使用。
配制后之培养基应放置于2～8℃冰箱中保存，但须于一个月内使用完毕。
2.2.28.4 阪崎肠杆菌培养基（Enterobacter sakazakii agar, ESA）胰化蛋白胨（tryptone）15 g大豆蛋白胨（soya peptone） 5.0 g氯化钠（NaCl） 5.0 g柠檬酸铁铵（ferric ammonium citrate） 1.0 g脱氧胆酸钠（sodium desoxycholate） 1.0 g硫代硫酸钠（Na2S2O3．5H2O） 1.0 g5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-哌喃葡萄糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside） 0.1 g洋菜（agar）15 g蒸馏水1000 mL搅拌加热溶解后，以121℃，灭菌15分钟，最终pH值为7.3 ± 0.2。
