第十六章 重组DNA技术
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DNA重组技术不同来源的DNA分子,通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程,称为DNA重组(DNA recombination)。
重组DNA技术(recombinant DNA technology)作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。
利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接,构成重组DNA分子,然后把它导入宿主细胞,进而扩增相关DNA片段,表达相关基因的产物,是进行基因功能研究的基本方法。
克隆(clone)是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。
构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系,即DNA的分子克隆(molecular cloning)过程。
因此,重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术,其具体过程大致为分、切、连、转、筛选。
即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。
载体选择载体(vector)是携带靶DNA(目的DNA)片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。
常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。
目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型,亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。
载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件:①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力;②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入,多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性;③分子量不宜过大,以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数,也有利于体外重组操作。
④具有合适的筛选标记,以便区分阳性重组体和阴性重组体,常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。
⑤配备与宿主相适应的调控元件,如启动子、增强子和前导序列等。
本试验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体,它含有Lac Z基因编码区、SP6、T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域(见图),能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于构建DNA或RNA探针的构建。
重组DNA技术介绍重组DNA技术是一种改变生物体基因组的方法,它包括将不同种类的DNA序列组合在一起,从而创建出新的基因组序列。
这项技术的出现引发了科学和医学领域的巨大进步,并在许多领域的研究中发挥着重要的作用。
DNA重组技术的原理DNA重组技术的基本原理是通过将所需的DNA片段插入到载体DNA中,然后将这个“重组”的DNA转移到宿主细胞中,使其表达目标基因。
具体步骤如下:1.DNA片段的获取:首先,需要获取到所需的DNA片段。
这可以通过多种方法实现,如利用限制性内切酶切割DNA、合成化学DNA等。
2.选择适当的载体:载体DNA是一个外源DNA分子,可以用来将目标DNA片段转移至宿主细胞中。
常用的载体包括质粒、噬菌体以及人工染色体等。
3.DNA连接:将目标DNA片段和载体DNA通过DNA连接酶连接起来,形成一个新的重组DNA分子。
4.转化宿主细胞:将重组DNA分子转移到宿主细胞中。
常用的方法包括化学法、电穿孔法以及使用噬菌体病毒作为媒介等。
5.目标基因表达:当重组DNA转移到宿主细胞中后,宿主细胞会开始转录和翻译这个重组DNA,从而产生所需的蛋白质。
重组DNA技术的应用重组DNA技术在许多不同领域中广泛应用。
以下是其中一些重要的应用:1. 基因工程重组DNA技术为基因工程提供了基础。
通过将外源基因插入到宿主细胞中,可以实现在宿主细胞中大量表达目标基因。
这在制药工业中非常重要,可以用来生产各种药物,如人类胰岛素、生长因子等。
2. 农业重组DNA技术在农业领域中也有广泛的应用。
例如,通过将特定基因导入农作物中,可以使其具有某种特定的农艺性状,如抗虫性、抗病性以及耐旱性等。
这为作物生产提供了新的方法和机会。
3. 疾病研究重组DNA技术为疾病研究提供了强大的工具。
通过重组DNA技术,研究人员可以建立转基因动物模型,模拟人类疾病,从而更好地理解疾病的发生和发展机制。
此外,重组DNA技术还可以用于研究特定疾病的基因诊断和治疗方法。