第四节核酸的理化性质-变性、复性与杂交

第4讲核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术(DNA/DNAorDNA/RNA)核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)待测核苷酸序列(单链)主要内容第一节分子杂交技术的理论基础第二节核酸分子杂交的方法第三节核酸杂交的探针第一节分子杂交技术的理论基础核酸分子杂交技术：1968年华盛顿卡内基学院(CarnegieIntituteofWahington)的RoyBritten及其同事发明的关键步骤：变性—杂交(复性)--检测信号—结论变性复性DNA-DNA杂交双链分子信号的采集与处理结论一、DNA变性与复性(一)DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA 链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性2、变性的方法：1)热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。

2)酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。

3)化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂3、核酸溶液变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程)4、DNA变性曲线AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的变性DNA/总DNATm值：50%DNA分子发生变性的温度(即熔解曲线中点对应的温度),这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度(meltingtemperature,Tm)Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度5、GC含量与Tm值(meltingtemperature)之间的关系(G+C)%=(Tm-69.3)某2.44Tm=(G+C)%某0.41+69.3Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH值、离子强度和DNA的碱基比例DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/lNaCl溶液中较稳定(二)复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。

核算理化性质-讲义目录1.一般物理性质；2.核酸的紫外吸收；3.变性；4.复性；5.杂交；教学目的：了解核酸的一般物理性质及DNA序列的测定方法，掌握核酸的紫外吸收特性、变性和复性及核酸的分离、提纯和定量测定。

教学重点：核酸的紫外吸收及变性和复性；教学难点：核酸的变性和复性1.一般物理性质1.1形态DNA —— 白色纤维状固体 RNA —— 白色粉末状固体1.2溶解性微溶于水；不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；用乙醇可以沉淀核酸。

RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L NaCl溶液；DNP可溶于1~2mol/L的NaCl溶液；RNA在碱性溶液中不稳定； DNA在碱性溶液中稳定。

显色反应：利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。

核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。

脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。

1.3粘度DNA溶液粘度极高 (因其分子直径小而长度大)RNA溶液粘度要小得多★核酸变性或降解后，粘度降低1.4两性解离概念：核酸为两性电解质，因核苷酸含有磷酸基与碱基，磷酸基和碱基可以解离，在不同pH条件下解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子，表现为两性离子状态，通常表现为酸性。

效果：由于磷酸基团的酸性很强，所以pI（等电点）较低，整个分子相当于多元酸。

应用：利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。

2. 紫外吸收性质2.1机理：嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。

2.2性质1：在260nm处有最大吸收峰。

对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。

A260/ A280值可以反映核酸的纯度。

性质2：纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.02.3.定义：增色效应(hyperchromic effect)是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。

第四节核酸的主要理化性质一、核酸的一般性质⒈酸性化合物⑴两性\但酸性强。

⑵电泳行为--泳向正极（pH7-8）。

⑶沉淀行为--加盐（中和电荷）M+与磷酸"-"中和；乙醇。

⒉高分子性质⑴粘度大，DNA>RNA⑵超离心沉降⑶凝胶过滤二、核酸的UV吸收―――最大吸收峰在260nm附近⒈原因：嘌呤和嘧啶碱基都含有共轭双键⒉应用：定性、定量分析核酸；作为核酸变性和复性的指标⒊计算：课本P24第五节核酸的变性、复性与杂交一、 DNA的变性⒈定义：核酸在某些理化因素（温度、pH、离子强度等）作用下，DNA双链的互补碱基之间的氢键断裂，使双螺旋结构松散成为单链的现象。

⒉分类：根据变性因素区分为碱变性、热变性等。

如DNA的碱变性、DNA的热变性，其中DNA的热变性是实验室最常用的变性方法，它更具典型意义。

⒊变形后表现：粘度改变，钢性线性分子变得无序，粘度下降，UV吸收增强，其规律如下：⑴增色效应定义：（课本P25）述：核酸变性后、氢键破坏，双螺旋结构破坏，碱基暴露，紫外吸收（260nm）增强，又称高色效应。

⑵解链温度\融解温度（Tm）定义：UV吸收增值达到最大吸收增值50%时的温度称Tm。

⑶应用：①Tm与DNA G+C含量有关，G+C含量愈大Tm愈高，反之则反；②与核酸分子长度有关，分子愈长，Tm愈高。

③Tm值的计算公式：（（课本P25）说明：DNA变性时只改变其空间结构，不改变它的核苷酸序列。

二、DNA的复性⒈定义：（课本P25）述：DNA发生热变性后，经缓慢降温，如放置室温逐渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成氢键，恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复性。

⒉退火：热变性DNA经缓慢冷却后复性的过程，不发生复性。

⒊减色效应：核酸复性时UV下降，此称低色效应。

说明： DNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，形成氢键联系，两链维持分离状态。

⒋退火温度：DNA变性后，比Tm约低25°的温度三、分子杂交⒈定义：（课本P25－26）述：当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分子中含有相同序列的片段，可形成碱基配对，出现复性现象形成杂种核酸分子，称杂化双链及核酸分子杂交。

4.5核酸的性质核酸的性质一、解离性质多聚核苷酸有两类可解离的基团：磷酸和碱基能发生两性解离。

磷酸是中等强度的酸，碱基的碱性较弱，因此，核酸等电点在较低的pH范围内。

DNA等电点4—4.5RNA 等电点2—2.5RNA链中，核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链，促进磷酸酯羟基氢原子的解离。

二、水解性质1、碱水解室温，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。

在相同条件下，DNA不被水解。

这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。

DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。

DNA稳定，遗传信息。

RNA是DNA的信使，完成任务后降解。

2、酶水解生物体内存在多种核酸水解酶RNA水解酶RNaseDNA水解酶DNase核酸外一切酶核酸内切酶最重要的：限制性核酸内切酶三、光吸收性碱基具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax=260nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85），若大于1.8，表示污染了RNA。

纯RNA的A260/A280应为2.0。

若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。

2、含量计算1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单螺旋DNA（或RNA）或：20ug/mL核苷酸3、增色效应与减色效应增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。

四、沉降特性（DNA）不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），起密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来，这一方法常用于质粒DNA的纯化。

相对沉降常数线型双螺旋分子 1.00松驰双链闭环 1.14切刻双链环 1.14单链环 1.14线型单链 1.30正超或负超螺旋双链环状 1.41坍缩 3.0五、变性、复性及杂交变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。