下载文档原格式
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： 人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析 同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果二、操作步骤 四、讨论分析一、 实验目的及原理熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。
初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。
通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。
在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。
在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。
但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。
在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。
再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。
最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa 染色。
胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。
通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。
由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。
关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。
二、操作步骤人类外周血染色体标本制备１、采血２、培养RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。
3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。
就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。
一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。
2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。
3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。
二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。
2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。
3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。
三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。
2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。
3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。
4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。
四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。
2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。
加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。
3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。
4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。
5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。
6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。
五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。
2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。
3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。
4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。
六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。
2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。
3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。
4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告今天咱们来聊聊人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备这个实验。
说实话，听到这些名词，可能不少人脑袋都开始发懵了，觉得这不就是一堆复杂的科学术语吗？别急，咱们慢慢捋，听我给你讲讲。
这可不是要你背什么枯燥的理论，而是要带你一起走进实验的世界，让你感受到那种“哦，原来是这么回事”的瞬间。
毕竟，科学嘛，有时候就像拆礼物，总有惊喜！实验的核心就是“外周血淋巴细胞培养”。
乍一听，你是不是就想，外周血、淋巴细胞，都是啥玩意儿？咱们先聊聊外周血吧，这其实就是咱们常常说的“血液”啦。
血液里有好多种细胞，其中淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在咱们身体里干着“保卫战”的活儿，专门用来对付入侵的细菌、病毒什么的。
简单来说，外周血淋巴细胞培养，就是从咱们的血液里把这些“小卫兵”挑出来，然后在实验室里“喂养”它们，让它们活得更好，变得更强大。
你可能好奇，咱们怎么从血液中把这些淋巴细胞分离出来呢？这个过程就像是“捞金子”。
先把血液给分离开，过滤掉那些不需要的部分，然后通过一些化学方法把淋巴细胞从里面提取出来。
想象一下，就像在沙滩上捡贝壳，虽然周围一片沙子，关键是得挑到最闪亮的那个！而这些淋巴细胞就像是你捡到的宝贝，咱们要把它们培养得越来越强，看看它们会变成什么样子。
咱们要讲到“染色体标本制备”了。
这一步可以说是实验的“高光时刻”，也是最让人兴奋的地方。
你想啊，细胞里的染色体其实就是所有遗传信息的“宝藏”，它们决定了咱们长得像谁、会不会秃头、是不是容易发胖，这些东西统统都藏在里面。
所以，看看这些染色体的“真面目”就成了实验的终极目标。
为了能看清楚它们，咱们要用一些特殊的染色技术，让染色体变得更“显眼”。
你可以想象，染色体就像一张复杂的地图，原本是密密麻麻、看不清楚的，但一旦染上颜色，它们就变得清晰可见，咱们才能一目了然地分辨出它们的结构和形态。
在这个过程中，首先咱们得让细胞分裂。
外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析一、实验目的（1）、熟悉淋巴细胞体外培养原理。
（2）、掌握人体微量血液体外培养技术。
（3）、通过本次实验掌握制备染色体标本的方法。
（4）、观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
（5）、培养学生的自主能力，锻炼学生的动手操作能力。
二、实验原理外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G1期（或Go期）一般情况下是不再分裂的在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养秋水仙素的处理低渗和固定就可获得大量的有丝分裂细胞。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。
人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。
本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。
在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。
植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。
利用 PHA 这一特性, 淋巴细胞经过含有 PHA 培养液培养, 在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体, 终止分裂中期的淋巴细胞, 经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。
最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。
即可得到所需的人体染色体图形。
染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。
外周血染色体制备与分析技术规范原理：在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。
植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。
具有用血量少、操作简单等优点。
1、实验材料2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。
2、培养液配制无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：RPMI 1640或199 90%小牛血清 10%PHA（自制） 0.1ml 3%肝素 10u/ml 2%双抗 100u/ml（选择）分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。
3、植物油凝素的制备植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。
自制的方法常用生理盐水提取法。
（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。
恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。
每8-12小时摇荡一次。
（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。
在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。
注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。
掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。
2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。
3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。
二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。
人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。
染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。
通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。
在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。
G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。
正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。
染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。
根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。
表1 人染色体组型及其特征组别染色体序号形态，大小着丝点位置次缢痕随体A 1~3 最大中部着丝粒（1，3）亚中部着丝粒（2）1号染色体B 4~5 次大亚中部着丝粒C 6~12X 中等亚中部着丝粒9号染色体D 13~15 中等近端着丝粒有E 16~18 小中部着丝粒亚中部着丝粒16号染色体F 19~20 次小中部着丝粒G 21~22Y 最小近端着丝粒有三、实验试剂与器材试剂：抗凝剂：肝素溶液（500U/ml）；培养基：RPMI1640, 按照说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。
小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56℃水浴条件灭活。
植物血球凝集素（PHA）：市售，按说明书要求使用 5%NaHCO3秋水仙素：已有，1ug/ml，根据需要量取！低渗溶液：0.075mol/L氯化钾班上同意配制，我们组负责配！Carnoy固定液Giemsa染液：磷酸缓冲液（pH6.8）10ml加Giemsa原液0.3ml，用时配制。
器材：光学显微镜1台，离心机1台，恒温水浴箱1台，恒温箱1台，离心管17支，量简2个，烧杯2只，培养瓶2个，载玻片8张，玻片架2台，注射器4支，枪头2支，移液枪2支，胶塞2个，标签纸1圈，碘酒和酒精棉球，酒精灯，1台，天平1台，普通冰箱1台，立式染缸 1个、染色架 1个、镊子3个，直头小吸管 14支、橡皮吸头14个、吸水纸若干，香柏油，擦镜纸，剪子 1个，胶水。
正常人类染色体G带核型图，核型报告纸四、实验方法（一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）；每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含：RPMI1640 4ml灭活小牛血清1mlPHA 2.5mg依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀，用5%NaHCO3调节培养基的pH值至7.2-7.4。
（二）采血与培养：先以碘酒和75%乙醇消毒皮肤。
用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml 肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血1ml。
转动针筒以混匀肝素常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台，在火焰旁将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。
贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养72h。
（每天摇动培养瓶一次）（三）秋水仙素处理:向经恒温培养68-72小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素，使其终浓度为0.4ug/ml,即每瓶（内装5ml培养基）中用6号针头倾斜45度角滴4滴，轻轻将液体摇匀，继续恒温培养3-4小时。
（四）标本的制备:1、终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀10分钟(1000r/min)，弃去上清液。
2、加入37℃预温的低渗液8m1，轻轻打匀，置37℃水浴箱中20分钟。
（使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。
）3、低渗处理完毕后，直接加入新配的固定液1 m1进行预固定，混匀后，离心10分钟(2000r/min)。
4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入固定液4m1，轻轻吹打混匀，置室温15分钟。
5、离心沉淀1000 r/min，10分钟。
6、弃去上情液，再加入固定液4m1吹打均匀重悬细胞，固定10分钟。
7、离心沉淀1000 r/min，10分钟。
8、重复固定一次。
9、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液(0.3～0.6m1)，轻轻吹打成细胞悬液。
10、滴片：取保存在冰水中的冷湿载玻片1张，稍倾斜，用滴管吸取细胞悬液，从30~40cm 高处滴2滴于玻片上，立即用口对准玻片吹气，使细胞在玻片上散开，然后在酒精灯上略烘一下(勿全烘干，过火3-5次)，在空气中待干。
（四）染色：1、滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上，使片、板之间有一缝隙，将稀释后的Giemsa染色滴在片隙中，室温染色20分钟；2、自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面）3～5秒钟，晾干；3、镜下观察染色体分带及染色情况。
五、实验结果1、观察自己制作的标本片中染色体的形态、颜色及其显带情况，记录并说明原因。
计数10个细胞的染色体数。
2、试述染色体G显带技术在人类染色体识别中的意义。
3、绘出一套完整的中期分裂细胞的染色体图；根据课堂提供的材料，排列初一份正常人类染色体G带核型图。
4、实验报告六、注意事项（一）细胞培养技术1、在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。
由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。
2、无菌操作的要领和要求1）培养前准备为做好培养前用品的充分准备工作，根据实验内容的要求收集好已消毒的所需用品，清点无误后置于超净工作台内，这样可避免操作开始后由于用品不全、往反取物而增加污染机会。
2）超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒20-30分钟，然后关闭紫外灯打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台内可保持无菌环境。
为防止培养细胞和培养液等受到紫外线照射，消毒前应予先放在带盖容器内或在操作时随手携入。
3）洗手操作时因整个前臂要伸入超净工作台内，所以洗手时，一定要洗刷到肘部，然后用0.2% 新洁尔灭擦洗或用75%酒精棉球擦试。
4）火焰消毒在超净工作台无菌环境中操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作如安装吸管橡皮头、打开或加盖瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。
注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。
烧过的用具都要待冷却后再接触细胞，否则会烧焦形成炭膜，再用时会把有害物质带入培养液中。
5）操作进行培养操作时动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动增加污染机会。
不能用手触及器皿的消毒部分。
如已接触，要用火焰烧灼消毒或更换。
为拿取方便，工作台面上的用品要有合理布局。
原则上是右手使用方便的用品放在右侧，左手使用方便的用品放在左侧；酒精灯置于中央。
培养液等不要过早开瓶，打开的培养液和培养用瓶等应保持斜位或平放，长时间开口直立，易增加落菌机会。
吸取各种用液时均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。
（二）染色体染色体是生物细胞中的一个重要的组成部分，每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体。
染色体能通过细胞分裂而复制。
并且在世代相传的过程中具有稳定地保持形态、结构和功能的特征。
染色体是遗传物质的载体。
人类99%的遗传物质位于染色体上。
染色体数目、结构的改变将导致染色体病。
（三）操作1、接种的血样越新鲜越好，最好是在采血后24h内培养，如不能立刻培养，应置于4℃冰箱存放，避免保存时间过久，以免影响细胞的活力。
培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻震荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养，最好每天轻轻震荡混匀一次。
2、Giemsa为噻嗪类染料,其碱性成份天青B与DNA分子中的磷酸基结合,蛋白质在一定的环境中,具有不同的嗜酸性和嗜硷性倾向,出现着色差异易于观察。
因此染液PH值对着色效果有影响。
当呈淡灰色带纹不显时,应调节染液pH值7.0~7.2,复染10min,可获得鲜亮的显色效果。
3、在采血接种培养是，不要加入太多的肝素。
肝素太多可能引起溶血、抑制淋巴细胞的转化和分裂。
但肝素量也不应太少，以免发生凝血或培养物中出现纤维蛋白形成的膜状结构。
这种膜状物一般在培养24小时左右出现，此时可在无菌条件下将它除去以免影响培养效果。
4、在普通培养箱内培养时，必须将培养瓶口盖紧，以免培养液的PH发生较大的变化。
如果培养过程中，培养液酸化比较严重（培养液呈黄色时）将不利于细胞生长，此时可加入适量无菌的0.14%碳酸氢钠溶液调整或再加入2～3ml培养液来校正。
培养箱的温度应控制在37℃+0.5℃，温度过高或过低都会影响细胞的生长。
5、染色体标本质量不佳的原因。
如果淋巴细胞转化试验表明培养物生长发育良好，但制成的标本质量不佳时，其原因可能为：⑴秋水仙素处理不当：一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。
⑵低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。
⑶离心速度不合适：如果从培养瓶收集细胞后进行离心时的速度太低，细胞可能被丢失；如果细胞被低渗后离心速度过高，往往使分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相丢失，以致制出的标本分裂相较少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。
⑷标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。
