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HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
高效液相色谱法(HPLC)一．概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。
现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。
HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1．HPLC的特点（1）适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。
HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。
（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。
（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。
（6）样品易回收。
2．HPLC分类按分离机理分为四类：吸附色谱（液固）：通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。
对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱：不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。
现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。
大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱：以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。
用于分离无机或有机离子。
固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱：按物质分子量大小进行分离。
不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。
它又分为用于非水体系的凝胶渗透色谱（GPC），用于高聚物分子量及其分布的测定。
又有适于分离和表征水溶性高聚物的凝胶过滤色谱。
分子排阻色谱主要用于生物化学和高分子化学，在有机化学中应用也日益增多，已成为HPLC的一个重要分支。
上述四种是HPLC的重要分支，各有不同分离机理和应用领域，各有独到之处。
3．气相色谱的基本理论对HPLC的发展起了指导和推动作用，并自然延伸到液相色谱。
二．液相色谱仪HPLC流程现代HPLC按用途分为分析型、制备型、专用型（GPC），其基本部件相同。
HPLC仪由输液系统，进样系统，柱系统、检测和记录系统组成。
高压泵，色谱柱和检测器为三大关键部件。
4．溶剂贮存器和溶剂脱气（1）简单的贮液器为500ml 试剂瓶，盖严，防溶剂挥发，瓶内泵吸液管端装10ul不锈钢烧结滤头过滤溶剂。
溶剂应预先过滤。
（2）流动相脱气流动相进泵前必须脱气，尤其是水和极性溶剂。
否则过柱以后，压力降低放出溶解的空气。
气泡将影响分离效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作。
脱气法：微型真空泵在线脱气，适于单一溶剂（如GPC）。
吹H e脱气，如H e脱气机在线脱气。
超声波脱气等。
5．输液系统一高压泵色谱柱用细粒填料，填充紧密，液体流动相粘度高，阻力大，必须高压输液。
泵为关键部件，直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。
要求：A 输出压力高：一般为150~300kg/cm2压力，最高达500 kg/cm2.B流量范围宽：0.1~10ml/min 连续可调C 流量稳定: 流量恒定无脉冲,流量精度及重现性为+/- 0.5% 左右。
D 耐腐蚀：耐各种有机溶剂、水和缓冲溶液。
E 密封性好：泵室小便于清洗维修。
泵分为两类：恒流泵：柱阻力变化，流动相粘度变化，引起柱压变化而流量恒定，如往复柱塞泵。
恒压泵：流量可随外界阻力变化而输出压力恒定，如装柱用的气动泵。
HPLC广泛采用往复柱塞泵，由液缸，柱塞，单向阀和驱动机构组成。
密封圈耐磨（PTF-石墨）单向阀，柱塞为人造红宝石。
泵流量不稳使保留变化，直接影响峰面积重现性和定量精度，使噪音变大，最小检测量变大。
双柱塞泵流量平稳，输液精度高，流量精量+/-0.1% ，流量准确度+/-1% 。
双柱塞泵液缸容积很小（几微升~几百微升）适于梯度洗脱。
为提供无脉动的准确流量，在输液系统中还需加一些辅助设备：过滤器、混合器、阻尼器，测压装置。
多元混合溶剂需用比例阀，如二元、三元和四元比例阀。
溶剂按预定比例，低压混合后，经高压泵输入系统。
6．进样系统HPLC采用六通阀进样，重现性好，操作方便，易于自动化，大大提高了分析精度。
注射器进样：绝对误差在5%左右，相对误差在1%。
阀进样：误差均在1%以内。
进样量由定体积定量管和平头微量注射器控制，注射器体积应为定量管体积的2~3倍。
HPLC柱可注入较大体积的稀溶液，进样体积在10~250ul。
7．色谱柱HPLC发展与柱技术的突破是分不开发。
色谱柱是色谱仪的心脏，靠它实现分离。
柱要求：分离效率高，柱容量大，分析速度快。
色谱柱由柱管、凝胶填料、密封环、过滤板等部件组成。
色谱柱要耐高压，耐腐蚀，抗氧化密封不漏液，柱内死体积小。
对填料质量和装柱技术有严格要求。
每根柱都附有测试谱图、色谱条件和柱效、对称因子等数据，供用户判断柱质量。
色谱柱均用指定溶剂充满，防干裂和空气氧化，因而应定期用指定溶剂冲洗。
分析后，不能马上关机，应继续冲洗一段时间，保持柱内清洁。
调流速时，逐渐增减柱压，压力陡然升降，易使柱内形成沟槽损坏。
保护柱：在分析柱入口端加5~50mm与分析柱固定相相同的短柱，吸留过滤流动相及样品中的有害组分，可经常更换，起到保护延长分析柱的作用，加保护柱虽然柱效有所损失，但在经济和实用方面是有益的。
8．HPLC检测器连续地将柱中流出组分的含量随时间的变化，转变为易于测量的电信号记录为样品组分的分离谱图，进行定性定量分析。
在液相状态，流动相和样品的许多物理性质十分接近，找到既通用又灵敏的检测器是困难的。
相对GC而言，HPLC检测器是有待进一步发展的薄弱环节。
对检测器的要求：灵敏度高；对所有组分响应；线性范围宽，响应快；不易被溶剂腐蚀；死体积小，对流速，温度不敏感；操作方便。
通用型检测器：测定流出物（溶质+溶剂）某种整体参数的变化，如折射率，电导率，介电常数等。
示差折光检测器（RID）：通过连续测定流出液折光指数变化来测定样品浓度，检测器灵敏度与溶剂和溶质性质都有关系。
响应信号：R=Z Ci ( n I- n o ) z：仪器常数，Ci溶质摩尔百分数，n I 溶质折射率，n o溶剂折射率响应值与溶质浓度成正比，为浓度型检测器，响应值与溶质与溶剂间折光指数差( n I- n o )成正比；只要n I与n o 有足够差，即可检测，所以为通用检测器。
对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物，糖类，脂肪烷烃等都能检测，是GPC必不可少的检测器。
RID缺点：A 灵敏度低，为5 x 10-7 检测限：0.5ug/ml ; 比UVD低2-3个数量级B 对流量和温度变化敏感。
应严格控制，保持基线稳定，并带自动调零及自动冲洗检测池装置。
为保持流量稳定对泵的流量稳定性有很高要求。
RID带有恒温装置保持恒温，基于以上两点，RID仅用于常规分析也不能用于梯度洗脱。
（2）选择性检测器：只对某些被测样品或组分响应灵敏，而对流动相响应甚小。
如紫外、荧光和电化学检测器。
紫外（UV）检测器：几乎所有LC仪都配备。
用于检测能吸收紫外光的物质，选用工作波长无紫外吸收的溶剂作流动相。
工作原理：适用朗伯-比耳定律A= ΣCL A：摩尔消光值Σ：摩尔吸收系数C：溶液摩尔浓度L：光程长度UV吸收与浓度成正比为浓度型检测器。
可变波长紫外检测器：按照被测试样品的紫外吸收特性任意选择工作波长，以提高仪器的选择性。
其优点：（1）可以选择样品的最大吸收波长作为检测波长，提高检测灵敏度。
（2）可以选择样品有强吸收而干扰无吸收的波长处进行分析，提高分析的选择性。
通常意义的可变波长检测器，就是装有流通池的紫外分光光度计，基结构见下图。
光源为氘灯，高压氘气被电子激发放电形成连续发射光谱，使用范围在195nm~400nm之间，光强度大，稳定性好。
从氘灯发出的多色光经过透镜及滤光片聚焦在单色仪（主要部分为光栅）的入口狭缝上，转动光栅（改变波长）将选择性地将一窄谱带的光透过出口狭缝。
在分束器上分为两个光路，双光路利用两个光电二极管分别接收来自样品和参比池的光束，以光强差为输出信号，提高了检测器稳定性。
UVD 特性：灵敏度较高：10-9g ；线性范围宽：105 ；选择性强；受流量温度影响小，稳定性强，操作方便，适于梯度洗脱。
紫外检测器的使用率占各种检测器的70%左右；对占物质总数约80%的有紫外吸收的物质有响应。
为使紫外检测器灵敏、稳定，所选溶剂紫外吸收波长上限应低于测定波长。
光电二极管列阵检测器（PDAD）同时进行多波长快速扫描，得到时间-波长-吸收值三维谱图，对色谱峰的定性和纯度判别很有用处。
9．液相色谱仪柱外效应的影响在HPLC中，样品在液体中扩散系数比气体中小4~5个数量级，流速慢2~3个数量级。
因此，从进样到检测，除柱以外的任何死体积（进样器，柱接头，连接管，检测器）都导致峰加宽，柱致下降。
因此尽量减少柱外死体积影响。
三．溶剂GC只是固定相与样品有选择性作用，流动相为惰性载气。
LC固定相、流动相与样品分子都发生选择性相互作用，流动相在分离中起重要作用。
对于LC分析，首先按样品性质选择合适的LC类型，当固定相选定后，分离成功与否就在于流动相选择。
1．LC溶剂的实用要求：（1）使柱性能稳定避免使用与固定相发生不可逆吸附的溶剂；柱长期使用，溶剂中杂质在柱上长期积累，使柱性能变化。
HPLC对溶剂纯度要求很高，可购HPLC试剂或通过蒸馏提纯，除去大部分有紫外吸收的杂质。
（2）溶剂对样品各组分的溶解能力HPLC往往通过改变溶剂组成来改善分离，此时应注意对组分溶解度的影响。
应尽可能用初始流动相溶解样品，以防样品发生沉淀的可能。
如流动相不能溶解样品，溶剂必须与流动相互溶，且注入少量样品。
（3）溶剂与检测器匹配UVD所选溶剂的紫外吸收波长上限应低于工作波长，以提高灵敏度，降低噪音。
RID灵敏度与样品组分与流动相间折光率差值成正比，应选取差值较大溶剂。
(4) 溶剂沸点、粘度和安全性沸点低通常粘度低，低沸点、低粘度溶剂一般柱压低传质快，柱效高。
一般低沸点溶剂非常易燃，实验室要有良好通风。
HPLC 常用溶剂已烷，二氯甲烷，乙醚，乙腈，甲醇和水，解决90%HPLC问题。
此外尚有：异辛烷，CCL4，H CCL3 ，2-氯丙烷，THF，二氧六环，异丙醇，乙酸乙酯，醋酸。
