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免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结一、细胞培养细胞培养是指将动植物的细胞或者组织块继代传入含有营养物质的培养基中，在适宜的环境条件下进行培养和繁殖。
细胞培养常用的步骤包括：1.选择合适的细胞株和培养基，根据研究需要选择不同类型的细胞株和相应的培养基。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等。
2.细胞解冻或分离，将细胞解冻或分离后，将细胞悬液加入培养基中。
3.细胞培养和传代，将细胞培养在37摄氏度，5%CO2的细胞培养箱中，定期检查和观察细胞的生长情况。
当细胞密度达到一定程度时，进行细胞传代。
二、细胞处理细胞处理是指在细胞培养过程中添加不同的处理物质，用来观察细胞对各种刺激的反应或研究细胞功能和代谢等。
常用的细胞处理方法包括：1.药物处理，将目标药物或化合物加入细胞培养基中，观察细胞对药物的反应，如细胞凋亡、增殖等。
2.蛋白质表达或干扰，通过转染或基因表达技术，将外源蛋白质或RNA干扰片段导入细胞，研究细胞功能和代谢途径。
三、细胞传代细胞传代是指将细胞从当前的培养中分离出来，进行重新培养和繁殖。
传代一般在细胞密度达到一定程度时进行。
传代的步骤包括：1.蜕皮，将细胞培养基倒入培养皿中，轻轻摇晃培养皿，使细胞贴壁。
2.产生细胞质脱附剂，脱除老化细胞，补充新的细胞培养基。
3.转移细胞，将细胞悬液转移至新的培养皿中，继续培养和繁殖。
四、细胞荧光染色细胞荧光染色是一种常用的细胞实验技术，在研究细胞形态、结构、功能和代谢途径等方面具有重要作用。
常用的细胞荧光染色方法包括：1.DAPI染色，DAPI是一种特异性染色剂，能够与DNA结合并发出蓝色荧光。
DAPI染色能够直观的观察到细胞的核。
2.FITC染色，FITC是一种绿色荧光染色剂，可用于标记细胞内的蛋白质或特定的分子，如细胞骨架蛋白等。
3. Rhodamine染色，Rhodamine是一种红色荧光染色剂，常用于标记细胞内的蛋白质、RNA等。
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色。
Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果。
hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI（Propidium Iodide碘化丙啶）染色：是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶(Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料（红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）.但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡,那么PI单一染色也可以。
但是如果您一定要认定细胞的凋亡,那么PI单一染色显然不够！annexin—v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变。
其中，磷脂酰丝氨酸（Annexin-V,PS）外翻,Annexin—V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合。
这样，Annexin-v 染色阳性，表示细胞处于早期凋亡状态。
Annexin—V结合不同的荧光抗体，就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
Annexin V用FITC标记发绿色荧光;如果用PE标记就发红色荧光。
JC—1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集,低浓度时主要以单体（monomer)存在，发射光以绿光（～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体（aggregation），发射光以红光（-590nm）为主。
细胞染色方法总结Hoeｃｈst染色：ｈoｅｃhst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoecｈst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果。
ｈｏｅｃhst 有hｏｅchest33３42和hoechst3３2５8两种hｏｅchｓts33258，hoeｃｈst333４２二者区别不大,但是hｏeｃｈst33３42对细胞的毒性作用更小一些,所以一般来说hｏｅcｈsts3３2５8用于细胞固定后再染色，而hoechsｔ3３3４2则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI （Ｐroｐiｄium Ｉodide碘化丙啶）染色：是一种可对DＮＡ染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。
碘化丙啶（Ｐｒoｐidium Iｏdide, PI)是一种核酸染料（红色）,它不能透过完整的细胞膜,但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。
用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色)。
但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。
但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PＩ单一染色显然不够! annexin—v染色细胞凋亡早期，细胞膜标志发生改变.其中，磷脂酰丝氨酸(Annexin-V，PS）外翻,Annexin-Ｖ在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合．这样,Ａnnexin-v 染色阳性，表示细胞处于早期凋亡状态.Anneｘｉn－V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用ＰE标记就发红色荧光....文档交流仅供参考...JC-1染色ＪＣ－１是一种阳离子染料,可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体（monomer)存在,发射光以绿光(～52５nm）为主;而在高浓度时则可以形成多聚体（agｇregａｔioｎ）,发射光以红光(-590nm)为主.线粒体本身存在一定的极性（polarizaｔion),其外膜为负极，内膜为正极。
精品文档实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。
为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。
在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。
能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。
1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂( 如 Decon)浸泡 5min，间或振荡。
2、用自来水冲洗 5min。
3、以 1％盐酸— 70％乙醇溶液浸泡5min。
4、烤箱干燥 ( 至此即可用于普通染色 ) 。
5、多聚 L- 赖氨酸 (1:10 溶于去离子水 ) 浸泡 5min，振荡。
6、入 60℃烤箱 1 h，或室温过夜干燥 ( 用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学 ) 。
二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。
同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。
1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。
2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。
对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞， PBS漂洗 2～3 次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后， PBS液漂洗 2～3 次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。
3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。
主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇 ( 锇酸 ) 。
【实验贴士】免疫荧光染色，看完了闭着眼睛做实验！免疫荧光染色的主要是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，今天小编为你列举三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光1. 细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2. 用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3. 4%的甲醛室温固定20-30分钟4. 1×PBS洗3次，每次10分钟5. 0.2%Triton X-100透化2-5分钟6. 1×PBS洗3次，每次10分钟7. 5%BSA室温封闭30分钟8. 加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9. 1×PBS洗3次，每次10分10. 加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11. 1×PBS洗3次，每次10分钟12. 95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释'细胞爬片的免疫荧光1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS 洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6. 二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7. 最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8. 蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
细胞免疫荧光实验步骤第一步：样本准备1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。
2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。
3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。
第二步：固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织进行固定处理。
2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。
3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。
4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。
第三步：抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。
一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。
2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。
3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。
4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。
5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。
6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。
第四步：显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。
2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。
3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。
细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。
不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤如下：
1.细胞培养：在无菌条件下，将细胞种植在适宜的培养基中，进行细胞培
养。
2.固定：在适宜的时机，弃去培养基，用冷的PBS清洗两次，然后使用适当
的固定剂（如4%多聚甲醛）进行固定。
3.透膜处理：在固定后的细胞中加入0.1% Triton X-100的PBS进行透膜处
理，以使荧光染料能够进入细胞。
4.抗体孵育：根据实验需求，选择适当的特异性抗体，加入细胞中，室温孵
育一定时间，使抗体与细胞内的目标蛋白结合。
5.洗涤：在抗体孵育后，用PBS洗涤细胞，以去除未结合的抗体和其他杂
质。
6.荧光标记：选择适当的荧光染料标记二抗，加入细胞中，室温孵育一定时
间，使二抗与结合的特异性抗体结合。
7.洗涤：再次用PBS洗涤细胞，以去除未结合的荧光染料和其他杂质。
8.观察：在荧光显微镜下观察染色后的细胞，观察目标蛋白的分布和定位情
况。
请注意，具体的实验步骤可能因不同的实验需求和条件而有所差异。
在进行实验前，建议仔细阅读相关文献和实验指南，以确保实验的准确性和可行性。
细胞免疫荧光染色实验
1.实验前一天将细胞接入铺有盖玻片的六孔板内（盖玻片预先用酒精浸泡30分钟左右，使用之前用酒精灯灭菌几秒钟，然后用镊子夹住盖玻片放入六孔板内）；
2.第二天，待细胞融合至70%左右开始进行染色；
3.弃去旧培养基，每孔加入1-2mlPBS，漂洗3min/次*3次；
4.吸出PBS，每孔加入预冷的4%多聚甲醛1ml，室温下固定细胞20min；
5.吸出4%多聚甲醛，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
6.吸出PBS，每孔加入0.5%TritonX-100 1ml，室温下孵育10min（0.5%TritonX-100用PBS 稀释）；
7.吸出0.5%TritonX-100，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
8.吸出PBS，每孔加入1ml 2%BSA（PBS稀释），室温下封闭30min-1h；
9.吸出2%BSA，勿洗；
10.每个盖玻片上滴加50ul左右一抗（一抗稀释比例根据说明书，用2%BSA稀释），置于4度过夜；
11.次日取出六孔板，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
12.吸出PBS，每个盖玻片上加入50ul左右荧光二抗（二抗稀释比例根据说明书，用2%BSA 稀释），室温下孵育1小时（我一般都是4度孵育过夜）；
13.每孔加入2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
14.吸出PBS，每孔加入染核试剂（DAPI或Hoechst），按照说明书操作；
15.吸出染核试剂，用PBS漂洗3次；
16.加入10-20ul封片剂封片；
17.荧光显微镜下观察拍照（封片好的细胞样品可于4度存放2周以上甚至一年）。
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合 (主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种 hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。
但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI 单一染色也可以。
但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。
JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
细胞免疫荧光显微镜实验步骤
介绍
细胞免疫荧光显微镜实验是一种常用的实验技术，用于研究细
胞中特定抗原的分布和活动状态。
本文档将介绍一个基本的细胞免
疫荧光显微镜实验步骤。
实验步骤
1. 准备细胞样品：将需要研究的细胞培养在培养皿中，确保细
胞生长状态良好。
2. 固定细胞：用冷甲醇或乙醇将培养皿中的细胞进行固定处理，使细胞膜完整，抗原不被破坏。
3. 清洗细胞：用PBS缓冲液轻轻洗涤固定后的细胞，以去除残留的固定液和培养基。
4. 抗体染色：将含有特定抗体的染色液滴在细胞上，使抗体能
与目标抗原结合。
5. 清洗细胞：用PBS缓冲液轻轻洗涤被染色的细胞，以去除未结合的抗体。
6. 二抗染色：将与第一抗体结合的二抗（荧光标记的抗体）滴在细胞上，使其结合到已结合的第一抗体上。
7. 清洗细胞：用PBS缓冲液轻轻洗涤被染色的细胞，以去除未结合的二抗。
8. 加荧光染料（可选）：如果需要增强荧光信号，可以在细胞上加荧光染料，但需避光保护。
9. 覆盖玻片：将细胞样品倒置于载玻片上，并用明胶或封片胶将其固定。
10. 显微镜观察：将载玻片放置在荧光显微镜上，选择相应的荧光滤光片，通过目镜或数码相机观察和记录细胞荧光显微图像。
结论
这些步骤提供了一个基本的细胞免疫荧光显微镜实验流程。
实验者在进行实验时应根据具体的实验要求和细胞特性进行合理的调整和优化。
注意：在进行这些实验步骤时，应遵循实验室安全操作规范，并确保所有试剂和设备的正确使用和处理。
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光。
实验步骤如下：1.已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
2. 细胞半干时，覆盖以4%冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。
3.吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。
4. 0.5%Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30分钟。
6. 配制一抗（SAB2104246-50UG, Sigma, USA）：SAB+FBS=1:200。
7.加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。
次日：8.取出细胞复温至室温约1h。
9.冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
10.配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRITC，用PBS或FBS配制。
浓度1:20011.加入二抗，室温孵育1小时(避光)。
12. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
13.DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。
14. 冰1‰Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。
冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。
15.加入防荧光淬灭封片剂，避光。
16.上机confocol建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。
2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
4.不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。
实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞;在进行各种染色前常需先制备成涂片..为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落;必须使其牢固贴附于载玻片上..在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一..能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等;这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法..1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂如Decon浸泡5min;间或振荡..2、用自来水冲洗5min..3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min..4、烤箱干燥至此即可用于普通染色..5、多聚L-赖氨酸1:10溶于去离子水浸泡5min;振荡..6、入60℃烤箱1 h;或室温过夜干燥用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学..二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来;避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等;使细胞和组织内的各种酶失去活性;防止细胞和组织的各种分子变性、解离;使细胞的化学物质和酶能准确定位;并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏..同时;固定还可使细胞的各部分易于着色;适于观察、长期保存和分析..1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法..2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物;如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料..对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说;常通过离心收集细胞;PBS漂洗2～3次后;备固定制片；对盖片单层培养物来说;将盖片从培养器皿中取出后;PBS液漂洗2～3次;以洗去血清和附着于细胞表面的残渣;备固定用..3.常用固定液：常用的固定液分两类;一类是以单一化学物质配成的固定液;称简单固定液..主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇锇酸..另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液;称混合固定液..如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、 Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等..不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同..因此;选择合适的固定液是达到固定目的的基础..14％甲醛-PBS:甲醛是一种气体;其饱和水溶液无色;约含40％甲醛..在很多情况下;甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀..4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快;并能较好地保存组织的外部形式;固定效果不受制片影响;固定材料可用苏木精和其他合成染料染色..甲醛的穿透力较强;对组织固定均匀;能增强组织的弹性;大标本的固定和保存多用甲醛..甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液;在冷冻切片中;甲醛作固定剂具有显著的优点..用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液..2丙酮：丙酮为无色易挥发液体;用纯冷丙酮4℃固定细胞内酶效果较佳..3乙醇：乙醇又称酒精;固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等效果优良..无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定液..乙醇除有固定作用外;还具有硬化和脱水的作用..作为固定用乙醇的适宜浓度为70％～100％..乙醇的缺点是渗透力差;并使组织收缩..4醋酸：常用0.3％～5％浓度的醋酸作固定剂..醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合;醋酸不固定蛋白质;但能固定核酸..醋酸的穿透力很大;它对细胞的膨胀作用显著;这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合;所以;常用醋酸来减少其他固定剂引起的细胞收缩..细胞学技术中;它能防止细胞收缩;并能较好地保存染色体;还能把染色质沉淀成为可染色的块状体..5苦味酸：苦味酸是黄色结晶体;强酸;可溶于水、乙醇、苯和二甲苯;在水中的溶解度可因水温变化而变化..苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组蛋白和核酸..苦味酸的穿透力很慢;单独使用时;造成组织严重收缩..它和其他药物混合配制时;可以作为蛋白质的沉淀剂;同时可避免组织收缩、硬化;而且易于染色..所以在很多混合固定液中被广泛采用..作固定用的最适浓度为1％..6锇酸四氧化锇：锇酸是一种强氧化剂;不能同乙醇和甲醛混合使用..它的挥发性很强;挥发出来的气体能固定结膜;对眼睛很有害;所以操作时应特别注意..四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一;配制时先在棕色试剂瓶中盛入50～100ml 0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.0～7.4;再将装有1g锇酸的安培瓶放人PBS中;以玻棒击碎安培瓶;摇荡使锇酸溶解;备用..常用的固定液浓度为1％～2％..7戊二醛：戊二醛对组织的渗透率高;与蛋白质反应快;能较好地保存蛋白质;对微管和膜性结构保存亦比较好;并能较好地保存糖原..常用的戊二醛固定液配制方法列于表12-1..表12-1 常用的戊二醛固定液配制方法8甲醇／醋酸固定液：甲醇：醋酸为3:1的固定液是应用最广的一种培养细胞固定剂..甲醇穿透力好;醋酸固定蛋白效果好;两者结合;能使固定细胞形态不变..不仅最适用于固定染色体;而且固定的染色体适于Giemsa染色注意：此固定液宜现用现配..9FAA固定液：此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞;固定效果好..配制方法：90ml 80％酒精中加5ml冰乙酸和5m140％甲醛..10Carnoy固定液：Carnoy固定液是较好的非水溶性固定液;是显示细胞化学成分如粘多糖等时常用的固定剂;固定、保真效果好;但穿透力差;适于固定培养的单层细胞..配制方法：60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸..11Bouin固定液：用于固定双盖片法培养的标本;固定30分钟后;用70％酒精褪去苦味酸黄色;如不立即染色;可将标本保存在70％酒精中..本试剂适于固定组织细胞的糖原..配制方法：先将75ml饱和苦味酸100ml水中加1.2～1.4g过滤;加入25ml福尔马林40％甲醛;有沉淀时禁用;最后加入5ml冰醋酸;混和后存于4℃冰箱中备用..冰醋酸最好在临用前加入..该固定液对组织细胞穿透力较强;固定效果较好;保存的细胞结构完好..但因偏酸pH为 3～3.5;对抗原有一定损害..124％多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛为白色固体;在50ml蒸馏水中加入4g多聚甲醛;加热至60～70℃时;边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH;至液体清晰透明..用1mol/LHCl调节pH 至7.4;冷却后加入 0.01mol/LPBS液至100ml;4℃保存..本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白..三、常见的细胞染色方法1普通染色观察苏木精-伊红hematoxylin-eosin;HE染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法;也是把细胞作为标本保存的主要方法..对于贴壁培养的细胞;以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作..固定前先用Hanks液、PBS、BSS或生理盐水清洗培养物2次;去除妨碍染色的血清..固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上;以利操作..对于悬浮培养细胞;须先经离心沉淀1000r／min;10min;弃上清液后留少量液体;将细胞悬液滴于玻片上做成涂片;冷风吹干..1.1HE染色法1.1.1染液配制1苏木精染液：这里介绍鄂征1995改良的Mayer法..称取0.5g苏木精;5.0g 铵矾或钾矾;0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水..再加入30ml甘油; 2ml冰醋酸..混匀..过滤后即成母液..可长久保存..用蒸馏水以1:20稀释即成工作液;可用很长时间..每次染色前宜过滤;去除氧化膜..2伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分..将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或蒸馏水即成工作液..1.1.2染色程序1用10％甲醛福尔马林固定培养物30min;或以丙酮固定15min..2蒸馏水洗1次后;入苏木精染液5～10min染细胞核..3 入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min;脱去胞质的着色..此时核呈紫红色..4入碱性溶液碱化;使细胞核变成蓝色..如果时间允许;最好用自来水呈弱碱性长时间浸泡..也可入1％NaHCO3溶液..此过程须不断用显微镜监视;以掌握碱化时间..5蒸馏水洗1 min;去除残留的碱性溶液;否则影响伊红着色..6入伊红染液30s～1 min..7用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％2次各2min..如伊红为乙醇溶液;略去70％乙醇..8用二甲苯透明2次;各5min..9树胶封固..1.1.3染色结果细胞核呈紫蓝色或深蓝色;大部分细胞的胞质呈粉红色..如果胞质内含较多核糖体例如淋巴细胞则亦呈蓝色..1.2吉姆萨染色法此法可将细胞核与胞质同时染色;故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握;效果常不如HE染色稳定..1.2.1吉姆萨Giemsa染液的配制1取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油;置于60℃温箱;约3h后溶解..2取出后倒入50ml中性甲醇;即为母液..于棕色瓶可长久保存..需要注意的是;有的甲醇内含醋酸;会使染液中的伊红沉淀出来;不利染色..3将母液与0.1 mol／LPBSPh6.9～7.2按1:9混合即成工作液..吉姆萨染液对pH极敏感;偏酸时染色过红;偏碱时则过蓝..所以;工作液宜现用现配;保存时间不超过48h以免被CO2酸化..1.2.2染色程序1将标本用甲醇固定5～10min..2入吉姆萨液染色10～15min..可用染色缸；或将染液滴覆于标本..3蒸馏水清洗;空气干燥;二甲苯透明;树胶封固..1.2.3染色结果细胞核呈蓝或蓝紫色;胞质呈色与HE染色相仿..。
实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结关于染菌问题a常见的多为真菌感染，细胞瓶内可见白色菌丝。
一旦出现此种情况，需要立刻丢弃细胞瓶。
孵箱内重新进行灭菌处理b常见细菌感染如杆菌球菌支原体等c最近实验室出现黑胶虫染菌现象对于“黑胶虫”的处理方法：首先，血清买回来灭活前冻融应逐级冻融，即按照-20℃——4℃完全融化后，再置入水浴中，与室温一起升高到56度，这样的目的是避免温度骤变，导致血清中的营养物质丧失活性。
第二，血清灭活后分装保存。
按照每次用血清的量分装，尽量减少血清冻融的次数。
分装时注意无_第三，细胞培养时血清浓度稍大一些。
通常细胞培养血清浓度为10%-15%，但如果血清冻融次数过多，那营养物质丧失活性，按15%的浓度配制事实上达不到15%的营养成分，故培养基配置时一般用18%-20%的血清。
4关于细胞冻存a10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培养基b4℃,40分钟;-20℃,30分钟;-80℃,24h后液氮罐保存c如果冻存细胞多要先把冻存液配好放四度冰箱(因为DMSO放热，刚加进去和容易损伤细胞，常温DMSO对细胞毒性也大。
)d冻存的原则是慢冻快苏关于荧光染色实验步骤1细胞取出固定2h后，也可4℃保存多日后一起染色2将孔板内固定液（2.5%戊二醛或者4%多聚甲醛）吸出，用PBS 清洗3次，每次5分钟3用triton脱细胞液（0.1%浓度）包被样品5分钟，目的是增加细胞通透性，后用PBS清洗3次BSA封闭液封闭（具体看抗体的种属来选择包被液)37℃4h,也可以4℃过夜Ⅰ抗30um/well即可，37℃30分钟取出样品清洗3次，每次5分钟，加一次封闭30分钟加荧光Ⅱ抗（需避光）30um/well37℃30分钟注意：此步骤不用清洗上清液吸干，加DAPI（40ng/ml）浓度较好4分钟即可清洗5次荧光拍照注：细胞染色有多重方法，本实验仅是抗-α-actin染色实验。
其他染色方法有很多相近之处本总结有许多不足之处，需要不断完善，制定统一实验方法做流式检测，一般阳性指标可以检测CD73,29,105，阴性指标可以检测34,45等。
