实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结共42页文档

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结一、细胞培养细胞培养是指将动植物的细胞或者组织块继代传入含有营养物质的培养基中，在适宜的环境条件下进行培养和繁殖。

细胞培养常用的步骤包括：1.选择合适的细胞株和培养基，根据研究需要选择不同类型的细胞株和相应的培养基。

常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等。

2.细胞解冻或分离，将细胞解冻或分离后，将细胞悬液加入培养基中。

3.细胞培养和传代，将细胞培养在37摄氏度，5%CO2的细胞培养箱中，定期检查和观察细胞的生长情况。

当细胞密度达到一定程度时，进行细胞传代。

二、细胞处理细胞处理是指在细胞培养过程中添加不同的处理物质，用来观察细胞对各种刺激的反应或研究细胞功能和代谢等。

常用的细胞处理方法包括：1.药物处理，将目标药物或化合物加入细胞培养基中，观察细胞对药物的反应，如细胞凋亡、增殖等。

2.蛋白质表达或干扰，通过转染或基因表达技术，将外源蛋白质或RNA干扰片段导入细胞，研究细胞功能和代谢途径。

三、细胞传代细胞传代是指将细胞从当前的培养中分离出来，进行重新培养和繁殖。

传代一般在细胞密度达到一定程度时进行。

传代的步骤包括：1.蜕皮，将细胞培养基倒入培养皿中，轻轻摇晃培养皿，使细胞贴壁。

2.产生细胞质脱附剂，脱除老化细胞，补充新的细胞培养基。

3.转移细胞，将细胞悬液转移至新的培养皿中，继续培养和繁殖。

四、细胞荧光染色细胞荧光染色是一种常用的细胞实验技术，在研究细胞形态、结构、功能和代谢途径等方面具有重要作用。

常用的细胞荧光染色方法包括：1.DAPI染色，DAPI是一种特异性染色剂，能够与DNA结合并发出蓝色荧光。

DAPI染色能够直观的观察到细胞的核。

2.FITC染色，FITC是一种绿色荧光染色剂，可用于标记细胞内的蛋白质或特定的分子，如细胞骨架蛋白等。

3. Rhodamine染色，Rhodamine是一种红色荧光染色剂，常用于标记细胞内的蛋白质、RNA等。

Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色。

Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果。

hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI（Propidium Iodide碘化丙啶）染色：是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶(Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料（红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）.但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡,那么PI单一染色也可以。

但是如果您一定要认定细胞的凋亡,那么PI单一染色显然不够！annexin—v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变。

其中，磷脂酰丝氨酸（Annexin-V,PS）外翻,Annexin—V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合。

这样，Annexin-v 染色阳性，表示细胞处于早期凋亡状态。

Annexin—V结合不同的荧光抗体，就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。

Annexin V用FITC标记发绿色荧光;如果用PE标记就发红色荧光。

JC—1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集,低浓度时主要以单体（monomer)存在，发射光以绿光（～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体（aggregation），发射光以红光（-590nm）为主。

细胞染色方法总结Hoeｃｈst染色：ｈoｅｃhst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoecｈst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果。

ｈｏｅｃhst 有hｏｅchest33３42和hoechst3３2５8两种hｏｅchｓts33258，hoeｃｈst333４２二者区别不大,但是hｏeｃｈst33３42对细胞的毒性作用更小一些,所以一般来说hｏｅcｈsts3３2５8用于细胞固定后再染色，而hoechsｔ3３3４2则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI （Ｐroｐiｄium Ｉodide碘化丙啶）染色：是一种可对DＮＡ染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。

碘化丙啶（Ｐｒoｐidium Iｏdide, PI)是一种核酸染料（红色）,它不能透过完整的细胞膜,但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。

用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色)。

但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。

但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PＩ单一染色显然不够! annexin—v染色细胞凋亡早期，细胞膜标志发生改变.其中，磷脂酰丝氨酸(Annexin-V，PS）外翻,Annexin-Ｖ在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合．这样,Ａnnexin-v 染色阳性，表示细胞处于早期凋亡状态.Anneｘｉn－V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。

Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用ＰE标记就发红色荧光....文档交流仅供参考...JC-1染色ＪＣ－１是一种阳离子染料,可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体（monomer)存在,发射光以绿光(～52５nm）为主;而在高浓度时则可以形成多聚体（agｇregａｔioｎ）,发射光以红光(-590nm)为主.线粒体本身存在一定的极性（polarizaｔion),其外膜为负极，内膜为正极。

精品文档实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法一、爬片前盖玻片处理方法对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。

为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。

在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。

能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。

1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂( 如 Decon)浸泡 5min，间或振荡。

2、用自来水冲洗 5min。

3、以 1％盐酸— 70％乙醇溶液浸泡5min。

4、烤箱干燥 ( 至此即可用于普通染色 ) 。

5、多聚 L- 赖氨酸 (1:10 溶于去离子水 ) 浸泡 5min，振荡。

6、入 60℃烤箱 1 h，或室温过夜干燥 ( 用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学 ) 。

二、细胞固定常用方法固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。

同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。

1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。

2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。

对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞， PBS漂洗 2～3 次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后， PBS液漂洗 2～3 次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。

3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。

主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇 ( 锇酸 ) 。

【实验贴士】免疫荧光染色，看完了闭着眼睛做实验！免疫荧光染色的主要是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，今天小编为你列举三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光1. 细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2. 用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3. 4%的甲醛室温固定20-30分钟4. 1×PBS洗3次，每次10分钟5. 0.2%Triton X-100透化2-5分钟6. 1×PBS洗3次，每次10分钟7. 5%BSA室温封闭30分钟8. 加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9. 1×PBS洗3次，每次10分10. 加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11. 1×PBS洗3次，每次10分钟12. 95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释'细胞爬片的免疫荧光1. 取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS 洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6. 二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7. 最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8. 蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

细胞免疫荧光实验步骤第一步：样本准备1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。

2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。

3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。

第二步：固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织进行固定处理。

2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。

3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。

4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。

第三步：抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。

一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。

2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。

3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。

4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。

5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。

6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。

第四步：显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。

2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。

3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。

细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。

不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。

活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤如下：
1.细胞培养：在无菌条件下，将细胞种植在适宜的培养基中，进行细胞培
养。

2.固定：在适宜的时机，弃去培养基，用冷的PBS清洗两次，然后使用适当
的固定剂（如4%多聚甲醛）进行固定。

3.透膜处理：在固定后的细胞中加入0.1% Triton X-100的PBS进行透膜处
理，以使荧光染料能够进入细胞。

4.抗体孵育：根据实验需求，选择适当的特异性抗体，加入细胞中，室温孵
育一定时间，使抗体与细胞内的目标蛋白结合。

5.洗涤：在抗体孵育后，用PBS洗涤细胞，以去除未结合的抗体和其他杂
质。

6.荧光标记：选择适当的荧光染料标记二抗，加入细胞中，室温孵育一定时
间，使二抗与结合的特异性抗体结合。

7.洗涤：再次用PBS洗涤细胞，以去除未结合的荧光染料和其他杂质。

8.观察：在荧光显微镜下观察染色后的细胞，观察目标蛋白的分布和定位情
况。

请注意，具体的实验步骤可能因不同的实验需求和条件而有所差异。

在进行实验前，建议仔细阅读相关文献和实验指南，以确保实验的准确性和可行性。

细胞免疫荧光染色实验
1.实验前一天将细胞接入铺有盖玻片的六孔板内（盖玻片预先用酒精浸泡30分钟左右，使用之前用酒精灯灭菌几秒钟，然后用镊子夹住盖玻片放入六孔板内）；
2.第二天，待细胞融合至70%左右开始进行染色；
3.弃去旧培养基，每孔加入1-2mlPBS，漂洗3min/次*3次；
4.吸出PBS，每孔加入预冷的4%多聚甲醛1ml，室温下固定细胞20min；
5.吸出4%多聚甲醛，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
6.吸出PBS，每孔加入0.5%TritonX-100 1ml，室温下孵育10min（0.5%TritonX-100用PBS 稀释）；
7.吸出0.5%TritonX-100，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
8.吸出PBS，每孔加入1ml 2%BSA（PBS稀释），室温下封闭30min-1h；
9.吸出2%BSA，勿洗；
10.每个盖玻片上滴加50ul左右一抗（一抗稀释比例根据说明书，用2%BSA稀释），置于4度过夜；
11.次日取出六孔板，每孔加入1-2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
12.吸出PBS，每个盖玻片上加入50ul左右荧光二抗（二抗稀释比例根据说明书，用2%BSA 稀释），室温下孵育1小时（我一般都是4度孵育过夜）；
13.每孔加入2mlPBS，漂洗5min/次*3次；
14.吸出PBS，每孔加入染核试剂（DAPI或Hoechst），按照说明书操作；
15.吸出染核试剂，用PBS漂洗3次；
16.加入10-20ul封片剂封片；
17.荧光显微镜下观察拍照（封片好的细胞样品可于4度存放2周以上甚至一年）。

Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合 (主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种 hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。

但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI 单一染色也可以。

但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。

Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。

JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。