高效阴离子交换色谱法测定依诺肝素钠1_6_脱水衍生物含量_王悦

格式：pdf
大小：259.82 KB
文档页数：6

下载文档原格式

/ 6

关于高效液相色谱法对依诺沙星胶囊含量测定的分析

关于高效液相色谱法对依诺沙星胶囊含量测定的分析作者：刘扬王秋霞李建珍来源：《科学与信息化》2019年第21期摘要目的：分析高效液相色谱法测定依诺沙星胶囊含量的应用操作。

方法：使用高效液相色谱法对依诺沙星胶囊含量进行测定，色谱柱：Novapak-C18（3.9×150mm），流动相：乙腈-0.05mol.L-1柠檬酸（20：80），检测波长：266nm。

结果：本组研究显示，主峰面积与相应浓度在波长266nm，浓度为0.01μg—0.08μg范围内呈现良好的线性关系，测得平均回收率为100.6%，RSD=1.0%。

結论：高效液相色谱法测定依诺沙星胶囊含量的操作比较简便，重复性良好，检测结果比较准确，可以用作测定依诺沙星胶囊含量的有效方法。

关键词高效液相色谱法；依诺沙星胶囊；含量分析依诺沙星属于第三代氟喹诺酮类抗生素药物，具有广谱、强效杀菌功效，临床药用价值较高。

依诺沙星作为一种临床应用效果好，且应用范围较广的抗生素，分析其制剂中依诺沙星的含量对于评判药用价值，分析患者治疗效果以及治疗安全性等都具有十分重要的意义[1]。

高效液相色谱法是一种应用效果时间较长，且应用效果良好的测定依诺沙星含量的测定方式之一，能够通过高效液相色谱仪对依诺沙星胶囊的含量进行详细分析，得出相应的线性关系、精密度、回收率等情况[2]。

为了具体分析高效液相色谱法在测定依诺沙星胶囊含量中的作用，本文特对使用高效液相色谱法对依诺沙星胶囊含量进行测定进行研究，具体研究内容如下。

1 资料和方法1.1 一般资料使用高效液相色谱法对依诺沙星胶囊含量进行测定。

本次研究应用实验对象为依诺沙星胶囊样品以及依诺沙星对照品，研究所应用仪器为高效液相色谱仪、氢氧化钠、柠檬酸、乙腈等，研究应用色谱条件的色谱柱为Novapak-C18（3.9×150mm），流动相：乙腈–0.05mol.L-1柠檬酸（20：80），灵敏度为0.05AUFS，检测波长：266nm。

首批依诺肝素钠国家对照品1,6-脱水衍生物含量赋值的协作研究

首批依诺肝素钠国家对照品1,6-脱水衍生物含量赋值的协作研究王悦;李京;范慧红【期刊名称】《中国药事》【年(卷),期】2022(36)7【摘要】目的:建立首批1,6-脱水衍生物系统适用性对照品,完善国家标准。

方法:以欧洲药典依诺肝素钠对照品(EP Enoxaparin Sodium,Batch5)为系统适用性对照品,采用依诺肝素钠新国家标准草案“1,6-脱水衍生物”检查法,对依诺肝素钠国家对照品(批号:140810-201801)进行1,6-脱水衍生物含量测定,由全国14个药品检验机构及依诺肝素生产企业实验室协作标定。

结果:对依诺肝素钠系统适用性国家对照品(批号:140810-201801)1,6-脱水衍生物含量标定结果为20.3%,并对实验室内误差进行考察,14个实验室中有1个实验室(Lab1)标准差(SD)为1.8%,5个实验室(Lab2、Lab4、Lab10、Lab11和Lab13)的SD为0.5%~0.7%,其余8个实验室的SD值均小于0.5%。

对实验室间误差进行考察,有效数据的SD值为0.6%,相对标准偏差(RSD)为3.2%。

结论:经国家药品标准物质委员会审定后批准,依诺肝素系统适用性国家对照品(批号:140810-201801)增加1,6-脱水衍生物含量赋值,可以用于依诺肝素钠1,6-脱水衍生物检查系统适用性考察使用。

【总页数】8页(P772-779)【作者】王悦;李京;范慧红【作者单位】中国食品药品检定研究院化学药品质量研究与评价重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R95【相关文献】1.依诺肝素钠宽分布相对分子质量对照品研制2.国家对照品舒巴坦钠的协作标定3.首批肝素抗Ⅱa因子效价测定用国家标准品协作标定4.对比研究宽分布对照品测定依诺肝素钠分子量因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

低分子肝素质量标准研究_李京

肝素是临床广泛应用的一类抗凝血药物，属于高度硫酸化的糖胺聚糖。2008 年以来，国内外对肝素类产品的质量及质量标准问题十分关注［1-2］，欧洲和美国药典几次修订了肝素钠的药典标准，《中国药典》2010 年版也对肝素标准进行了大幅提高［3］。2009 年和 2010 年连续 2 年的全国药品评价性抽验结果表明，目前我国市场上的肝素钠注射液质量是可靠的［4］。低分子肝素［5］（ low-molecular-weight heparin，LMWH）是由肝素分级或降解得到具有较低相对分子质量的组分或片段，其抗血栓作用优于肝素，生物利用度高、出血倾向小，是肝素的第二代产品。2011 年 LMWH 注射剂评价性抽验暴露出我国 LMWH 产品质量及质量标准都存在一些问题，多批产品相对分子质量与活性不合格，质量标准与国外原研厂家的差距较大［6］。抗凝药市场销售额逐年上升，国内有多家企业同时进行新药申报，市场竞争激烈，对产品质量要求高。LMWH 已于 2012 年进入我国基本药物目录，是《中国药典》2015 年版备选品种，质量标准提高工作迫在眉睫。
ABSTＲACT： OBJECTIVE To revise the national specification low molecular weight heparin for improving the quality and quality control level its domestic products as candidate new varieties Chinese Pharmacopoeia 2015 edition. METHODS Domestic and imported original products and related information were collected，including 27 batches raw material from 11 manufacturers and 49 batches injections from 13 manufacturers. Domestic low molecular weight heparin products were classified according to the production process. The analysis focused on the verification structure，molecular weight and activity，process impurities，and degradation impurities. Various physical，chemical and biological methods were used，such as ion chromatography，size exclusion chromatography，reversed phase chromatography，gas chromatography，NMＲ，atomic absorption spectrometry，micro-chromogenic substrate methods，and so on. ＲESULTS The domestic low molecular heparin products were divided into three categories： dalteparin sodium，enoxaparin sodium，and nadroparin calcium. Eight draft specifications the raw material and preparations have been made. In the draft specifications，eight items have been added： structure type，production，1，6-anhydro derivatives for enoxaparin sodium，free sulfate，nitrite，benzyl alcohol，ultraviolet absorption maximum specific absorption enoxaparin sodium，and residual solvent； 15 items have been revised： Chinese name，English name，definition，characters，pH value，molecular weight and molecular weight distribution，anti-FⅩa activity，the ratio between anti-FⅩa and anti-FⅡa activity，the color the solution，sodium，sulfate and carboxylate ratio，loss on drying，volume injection，storage， preparation； one item has been deleted： light absorption at 260 and 280 nm. CONCLUSION The current draft specifications low molecular weight heparin have been greatly improved than the national specifications established in 2005. The products are divided into three categories. A lot items have been added and the limits are more reasonable. The draft specifications are roughly equal with the Europe

高效阴离子交换色谱法分离脱氧寡核苷酸片断

高效阴离子交换色谱法
高效阴离子交换色谱法（HPICE）是一种常用的色谱分离技术，它可以用来分离和纯化脱氧寡核苷酸（ODN）片断。

ODN是一种小分子的多肽，具有若干个碱基对，它们是由脱氧核苷酸基组成的。

ODN 片断在生物学研究中被广泛应用，例如用来研究基因功能、药物设计和免疫学等。

HPICE分离ODN片断的原理是利用ODN的阴离子性质与交换剂（通常是硫酸盐或磷酸盐）的阳离子性质之间的交换反应。

在HPICE分离过程中，ODN片断会与交换剂结合，形成阳离子，然后通过色谱柱向前移动。

在色谱柱的不同位置，ODN片断的浓度会有所不同，因此可以在色谱柱的不同位置取出ODN片断，从而达到分离和纯化的目的。

HPICE分离ODN片断的优点包括：分离效率高、分离速度快、分离成本低、可以分离出高纯度的ODN片断。

在实际应用中，需要根据ODN片断的特性（例如长度、序列、结构）和分离要求（例如纯度、回收率）来设计HPICE分离的实验条件，例如选择合适的交换剂、调整交换剂的浓度、选择合适的色谱柱和流动相。

在分离过程中，需要注意ODN片断的稳定性，因为ODN片断容易受到热、光、氧和酸碱条件的影响而降解。

为了保证ODN片断的稳定性，在分离过程中需要避免高温、光照和氧气的暴露，并且在酸性或碱性条件下进行分离时，也需要注意保持pH值的稳定。

在分离完成后，需要对ODN片断的纯度和回收率进行测定，以确保分离效果达到要求。

常用的方法包括电泳、质谱分析、免疫印迹等。

总的来说，HPICE分离ODN片断是一种高效、灵活的方法，在生物学研究中广泛应用。

但是在使用过程中，需要注意实验条件的调整和ODN片断的稳定性，以保证分离效果。

高效阴离子交换_脉冲安培法测定糖肽类药物中游离糖含量

－1 流动相 200 mmol · L 氢氧化钠溶液：取质量分数 50 % 氢氧化钠溶液（从试剂瓶中间取
仪器 ICS3000 型离子色谱仪（美国戴安公司），包括：溶液组织器 EO，单四元梯度泵 SP（带脱气装置），色
液，不要晃动试剂瓶） 32 g ，加水溶解至 2 000 mL ， 2 L 移至塑料淋洗液瓶中，立即用氮气保护（可使用 1 周）。 1 mol·L － 1 醋酸钠溶液（含 10 mmol · L － 1 氢氧化钠）：取醋酸钠 164. 06 g，加水溶解至 1 000 mL，将溶液移至 2 L 塑料淋洗液瓶中，取 50% 氢氧化钠溶液（从试剂瓶中间取液，不要晃动试剂瓶） 1. 6 g，加
表1 Tab. 1 高效阴离子交换脉冲安培法测定糖肽类药物中游离 The gradient of eluent in the research of quantification
电化学检测器 ED，自动加样器 AS，色谱箱组合 DC ，谱工作站 chromeleon 6. 70 SP1 。对照品 97. 0% ，半乳糖（ Chem service 公司，货号 0934 ）， 99% ， 939 ），货号 0蔗糖（ Chem service 公司， 1. 2 99. 5% ，货号 49139 ），葡萄糖（ FluKa 公司，甘露糖（ Aldrich 公司， 99% ， 284），货号 3458果糖（ Chem service 公司， 99% ，货号 0937 ）。 1. 3 试剂 OnGuard II ＲP 前处理氢氧化钠溶液，醋酸钠， 2. 5cc）。小柱（ Dionex， 1. 4 样品 2），薄芝糖肽原粉（厂家 Y，样品编号 1 、薄芝糖肽注射液（ 2 mL： 5 mg 多糖： 1 mg 多肽，厂家 Y，样品 4、 5），编号 3 、薄芝糖肽注射液（ 2 mL： 5 mg 多糖： 1 mg 多肽， 7 ）；甘露聚糖肽原料厂家 S，样品编号 6 、（厂家 L，样品编号 8 ），甘露聚糖肽注射液（ 2 mL： 5 mg，厂家 L，样品编号 9），注射用甘露聚糖肽（ 10 mg，厂家 J，样品编号 10 ），甘露聚糖肽口服液（ 10 mL： 10 mg，厂家 X，样品编号 11 ），甘露聚糖肽口服液（ 10 mL： 10 mg，厂家 C ，样品编号 12 ），甘露聚糖肽口服液（ 10 mL： 10 mg，厂家 A，样品编号 13 ），甘厂家 Q，样品编号露聚糖肽口服液（ 10 mL： 10 mg， 14 ），样品甘露聚糖肽口服液（ 10 mL： 10 mg，厂家 Z， 15 ）（ 5 mg ， L ，，编号厂家样品编号甘露聚糖肽片 16 ），厂家 Z，样品编号 17 ），甘露聚糖肽片（ 5 mg，甘厂家 A，样品编号 18 ），露聚糖肽片（ 5 mg，甘露聚糖肽胶囊（ 5 mg，厂家 L，样品编号 19 ）；云芝胞内糖肽 200301 ，国家对照品（ 140692样品编号 20 ）。

依诺肝素质量标准

依诺肝素质量标准1. 产品描述与定义依诺肝素是一种低分子量肝素，主要应用于肺血栓栓塞和静脉血栓栓塞等疾病的预防和治疗。

依诺肝素以注射剂的形式供应。

2. 性状和外观依诺肝素应呈无色或几乎无色、透明的溶液，不应有可见的异物。

3. 标准要求3.1 粒度依诺肝素注射剂的粒径分布应符合以下要求：- 95%的粒径应小于等于10微米；- 99%的粒径应小于等于15微米。

3.2 透明度依诺肝素注射剂的透明度应符合以下要求：- 使用2英寸玻璃比色皿检测，不得有可见沉淀或浑浊，光透过度应达到98%以上。

3.3 酸碱度（pH）依诺肝素注射剂的酸碱度应符合以下要求：- pH值应在5.0至7.0之间。

3.4 游离钠含量依诺肝素注射剂的游离钠含量应符合以下要求：- 游离钠含量不得超过每毫升15微克。

3.5 杂质依诺肝素注射剂中杂质含量应符合以下要求：- 重金属杂质（如铅、砷、铬等）含量不得超过每毫升5微克；- 其他有害杂质含量不得超过每毫升25微克。

3.6 活性成分含量依诺肝素注射剂的活性成分含量应符合以下要求：- 每毫升依诺肝素注射剂应含有不少于90国际单位的活性成分。

4. 性能验证与测试方法4.1 粒径测试方法：采用光散射法测定依诺肝素颗粒的粒径大小。

4.2 透明度测试方法：使用2英寸玻璃比色皿，对依诺肝素溶液的透明度进行测定。

4.3 酸碱度测试方法：采用电位法测定依诺肝素注射剂的pH值。

4.4 游离钠含量测试方法：采用离子选择电极法测定依诺肝素注射剂中游离钠的含量。

4.5 杂质测试方法：采用相关的色谱法或其他适用的分析方法对依诺肝素注射剂中的重金属和其他有害杂质进行测定。

4.6 活性成分含量测试方法：采用适用的生化法或其他准确的分析方法测定依诺肝素注射剂中的活性成分含量。

5. 包装与储存依诺肝素注射剂应采用符合相关药品包装标准的密封包装，并在阴凉干燥的条件下储存，远离光线和热源。

注：以上依诺肝素质量标准仅供参考，具体标准应根据实际情况和相关法规进行制定。

依诺肝素钠中残留铵的检测方法[发明专利]

专利名称：依诺肝素钠中残留铵的检测方法专利类型：发明专利
发明人：李铁健,杨欣茹
申请号：CN201910060320.9
申请日：20190122
公开号：CN111458418A
公开日：
20200728
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于医药技术领域，具体提供了一种依诺肝素钠中残留铵的检测方法。

以离子色谱法分析检测依诺肝素钠中的残留铵，采用高效阳离子交换柱分离，以阳离子自动再生抑制器或适宜的化学抑制器的电导检测器检测，以甲磺酸溶液为流动相，外标法定量检测依诺肝素钠中的残留铵。

本发明的检测方法，能够快速有效检测依诺肝素钠中的残留铵的含量，线性关系良好，精密度高，准确度良好，重复性和耐用性好，整个操作非常简单，填补了测定依诺肝素钠中残留铵含量的空白。

申请人：鲁南制药集团股份有限公司
地址：276005 山东省临沂市红旗路209号
国籍：CN
更多信息请下载全文后查看。

依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法[发明专利]

专利名称：依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法
专利类型：发明专利
发明人：周霞,林勇
申请号：CN201310088284.X
申请日：20130320
公开号：CN103175925A
公开日：
20130626
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种依诺肝素钠生产过程中肝素苄基酯的酯化率的检测方法，属于生物医药领域。

该方法采用反相液相色谱法，利用带紫外检测器的高效液相色谱仪对肝素苄基酯在碱性环境下脱落生成的苯甲醇进行定量检测，并以此反映肝素苄基酯的酯化率，从而达到控制依诺肝素钠成品质量的目的。

与现有技术相比，本发明的检测方法可以简单、快速、准确地监测肝素苄基酯的酯化率，从而降低依诺肝素钠成品的不合格风险和企业生产成本，具有很好的推广应用价值。

申请人：山东辰中生物制药有限公司
地址：272350 山东省济宁市鱼台县张黄镇工业园
国籍：CN
更多信息请下载全文后查看。

离子色谱法测定水中的七种阴离子

离子色谱法测定水中的七种阴离子
王永桔;叶露
【期刊名称】《污染防治技术》
【年(卷),期】2005(018)006
【摘要】采用离子色谱法对水中7种阴离子进行了测定,并对结果进行了分析.【总页数】2页(P51-52)
【作者】王永桔;叶露
【作者单位】无锡市锡山区环境监测站,江苏,无锡,214101;无锡市锡山区环境监测站,江苏,无锡,214101
【正文语种】中文
【中图分类】X832
【相关文献】
1.离子色谱法测定循环水中的六种阴离子 [J], 胡玉苗
2.离子色谱法测定饮用水及天然矿泉水中四种阴离子含量 [J], 岳虹;史燕华;尹睿杰;贺晓鸣;朱玉桃;于俊峰;李杰;吕志勇
3.单柱离子色谱法测定水中微量阴离子及其在测定水中吸附有机氯中的应用 [J], 严衍珠;唐瑛玉;郑雪昀;胡丽芝
4.HPLC法测定水中氟等七种阴离子 [J], 劳宝法;纪泓;冯芸;钱维梅
5.离子色谱法测定大气降水中低浓度无机阴离子的研究 [J], 胡晓艳;张丽明;汤彧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

依诺肝素钠中残留N,N-二甲基甲酰胺的测定

依诺肝素钠中残留N,N-二甲基甲酰胺的测定王悦;李京;李颖颖;范慧红【摘要】目的建立依诺肝素钠原料中N,N-二甲基甲酰胺残留的测定方法.方法采用乙醇作为萃取剂,使依诺肝素钠生成沉淀,N,N-二甲基甲酰胺则溶于乙醇,取上清液直接进样,用气相色谱仪分析.色谱柱为Agilent DB-wax(30m×0.53mm,1.0μm);载气为高纯氮气;流速为3 mL/min;采用程序升温的方式;进样口温度为200℃;FID检测器温度为250℃.结果该方法测得的线性范围为8.8～880 μg/mL;定量限为11.6 μg/mL;检出限为3.5 μg/mL;加样回收率为94.8％,RSD为2.0％.结论该检测方法方便、快速、准确,避免了样品基质对测定的干扰,可用来控制依诺肝素钠中痕量N,N-二甲基甲酰胺残留.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】3页(P168-170)【关键词】N,N-二甲基甲酰胺;依诺肝素钠;气相色谱法【作者】王悦;李京;李颖颖;范慧红【作者单位】中国食品药品检定研究院,北京100050;中国食品药品检定研究院,北京100050;中国食品药品检定研究院,北京100050;中国食品药品检定研究院,北京100050【正文语种】中文【中图分类】TQ460.72低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)是酶解或化学裂解肝素后得到的产物,其抗血栓作用优于肝素,生物利用度高、出血倾向小,是肝素的第二代产品［1］。

根据原料来源、生产工艺［2］、末端结构［3-5］的不同,低分子肝素被分为许多不同的种类,它们的分子量与分子量分布、硫酸化程度、抗凝活性均不相同［6］。

不同种类的低分子肝素在其生产过程中会使用到不同的有机溶剂;相同品种的LMWH也会由于不同工艺步骤而使用不同的溶剂,因此应分别控制。

依诺肝素钠是将肝素的苄基酯衍生物进行碱裂解而获得的一种低分子肝素,生产工艺较为复杂,在生产过程中除LWMH常用到的甲醇、乙醇等溶剂外,不同企业根据工艺不同,还会使用二氯甲烷［7］或N,N-二甲基甲酰胺等溶剂。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

·1462· Chin Pharm J，2014 August，Vol. 49 No. 16
收入依诺肝素钠新版国家标准草案的鉴别项目中。
1 仪器与试药 LC － 20AD 型高效液相色谱仪（日本岛津公司，
包括：DGU － 20A3 脱气装置； LC － 20AD 二元泵； SIL － 20AC 自动进样器； CTO － 10ASvp 柱温箱； SPD － 20A； UV 检测器； CBM － 20A 系统控制器； LC － Solution色谱工作站）。
中国药学杂志 2014 年 8 月第 49 卷第 16 期
Chin Pharm J，2014 August，Vol. 49 No. 16 ·1461·
分子肝素有许多不同的种类，它们的相对分子质量与相对分子质量分布、硫酸化程度、抗凝活性均不相同。依诺肝素钠（图 1）是将肝素的苄基酯衍生物进行碱裂解 β-消除而获得的一种低分子肝素，结构较为复杂，其结构特点是多数糖链的非还原端有一个 4-吡喃糖醛酸的结构，有 15% ～ 25% 的糖链在其还原端有特征双环结构（1，6 脱水葡萄糖和 1，6-脱水甘露糖）［2］，还原末端的 1，6-脱水衍生物的双环结构是其区别与其他品种低分子肝素的特征性指标。 1，6-脱水衍生物结构是解聚肝素生产依诺肝素过程中副反应的产物，该结构不会增加其活性，还可能会降低其与抗凝血酶的结合［3］，其含量可通过调整水解过程中的碱的量和反应时间加以控制［4］。
硫酸化大部分发生在 C6，少部分在 C3 和 2 位氨基上，艾杜糖醛酸和葡糖醛酸残基只有少部分在 C2 上硫酸化，乙酰化只发生在氨基葡糖的 2 位氨基上。氨基葡糖 C3 上的硫酸化是结合抗凝血酶（ AT III）所必需的［1］。
根据原料来源、生产工艺、末端结构的不同，低
基金项目：国家质量监督检验检疫总局公益性行业专项“双打”中药品检验检测技术方法研究，子课题《低分子肝素标准提高研究》资助项目
ABSTＲACT： OBJECTIVE To establish an HPLC method to determine the levels of the characteristic 1，6-anhydro derivatives of enoxaparin sodium. METHODS The enoxaparin sodium solution was depolymerized by a mixture of heparinases to obtaine di-or tetra-saccharide units，and the products were reduced by sodium borohydride and then analyzed by SAX-HPLC. The analysis was carried out on a Waters Spherisorb S5 SAX column （4. 0 mm × 250 mm，5 μm）. The mobile phase was composed of 0. 28 g·L －1 monobasic sodium phosphate solution （ A） and 140 g·L －1 sodium perchlorate solution （ B）（0 － 20 min，3% － 35% B；20 － 50 min，35% － 100% B；50 － 60 min，100% B；60 － 61 min，100% － 3% B，61 － 79 min，3% B） and the flow rate was 0. 8 mL·min －1. The column temperature was 50 ℃ and the detection wavelength was set at 234 nm. The normalized area percentage method was used for calculation. ＲESULTS One domestic heparinase factory was screened out that could pass the depolymerization suitability test，and the ratio of the peak area of 1，6-anhydro-ΔⅠS-ⅠS to that of 1，6-ΔⅠS was not more than 1. 15. In the optimal chromatographic condition，the resolution between reduced ΔⅠA and 1，6-anhydro-ΔⅠS was greater than 1. 5. The ratio of the peak area of ΔⅠS and reduced ΔⅠS of the reduced solution was less than 0. 02. The contents of 1，6-anhydro derivatives in the samples from two domestics factories were between 15% － 25% ． CONCLUSION This method can be used to separate and quantify the specific reduced end structures of enoxaprin. As the first test to analyze the LMWH’s structure，the method has already been included into the revised national standard draft for enoxaparin. KEY WOＲDS： enoxaparin； 1，6-anhydro structure； HPLC； heparinase Ⅰ，heparinase Ⅱ；heparinase Ⅲ；national standard
低分子肝素（ low molecular weight heparin，LMWH）是酶解或化学裂解肝素后得到的产物，具有与肝素相同的母体结构，即由双糖单位重复连接组成的线性糖链。双糖单位是由糖醛酸［β-D-葡萄糖醛酸（ G）或 α-L-艾杜糖醛酸（ I）］和 α-D-氨基葡糖（ GlcN）通过 1 →4 糖苷键连接而成。氨基葡糖残基的
高效阴离子交换色谱法测定依诺肝素钠 1，6 - 脱水衍生物含量
王悦，李京，李颖颖，范慧红* （中国食品药品检定研究院，北京 100050）
摘要：目的建立依诺肝素钠特异性末端结构 1，6-脱水衍生物结构的含量测定方法。方法肝素酶混合液将依诺肝素钠水解成二糖或四糖单位，水解得到的寡糖峰经硼氢化钠还原后用-高效阴离子交换色谱法方法进行分析。采用 Waters Spherisorb S5 SAX（4. 0 mm × 250 mm，5 μm）色谱柱，以 0. 28 g·L － 1 磷酸二氢钠溶液为流动相 A 含 0． 28 g·L － 1 磷酸二氢钠及 140 g· L －1 高氯酸钠的溶液为流动相 B 进行梯度洗脱（0 ～ 20 min，3% ～ 35% B；20 ～ 50 min，35% ～ 100% B；50 ～ 60 min，100% B；60 ～ 61 min，100% ～ 3% B，61 ～ 79 min，3% B），流速 0. 8 mL·min －1 ，柱温为 50 ℃ ；检测波长为 234 nm，并用归一化面积百分比法计算摩尔百分含量。结果筛选出了酶解效果达标的国产肝素酶并优化了酶解条件，酶解后 1，6-脱水 ΔⅠS-ⅠS 与 1，6-脱水 Δ ⅠS 峰面积比＜ 1. 15；优化色谱条件后 ΔⅠA 和 1，6-脱水 ΔⅠS 的分离度＞ 1. 5；硼氢化钠还原后的溶液色谱图中，ΔⅠS 和还原 ΔⅠS 的峰面积比均小于 0. 02；两家国产依诺肝素钠生产企业样品结果均在 15% ～ 25% 内。结论方法可对依诺肝素钠特征还原末端结构进行分离和定量，作为对低分子肝素进行微观结构分析的首个鉴别项目，已收载入新修订依诺肝素钠国家标准草案中。关键词：依诺肝素钠；1，6-脱水衍生物；高效阴离子交换色谱法；肝素酶Ⅰ；肝素酶Ⅱ；肝素酶Ⅲ；国家标准 doi：10. 11669 / cpj. 2014. 16. 021 中图分类号：Ｒ917 文献标志码：A 文章编号：1001 － 2494（2014）16 － 1461 － 06
美国药典依诺肝素钠对照品（批号：GOL137，美国药典会）；欧洲药典依诺肝素钠对照品（批号： batch4，EDQM 公司）；双糖对照品分别购自 Sigma 公司（ ΔⅠA、ΔⅣA、ΔⅡS、ΔⅢS）、Dextra 公司（ ΔⅡ A、ΔⅢA、ΔⅠS）和 Santa Cruz 公司（ ΔⅣS）；肝素酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 购自 Grampian Enzymes（ G）、苏州国镝医药科技有限公司（ D）、北京思清源生物科技有限公司（S）3 家公司；牛血清白蛋白为进口分装试剂；其他试剂均为国产分析纯。

（2012104008）；中国食品药品检定研究院中青年发展研究基金课题《低分子肝素质控对照品、标准试剂的制备及标化》资助项目（2012A5）作者简介：王悦，女，助理研究员研究方向：多糖类药物质量控制 * 通讯作者：范慧红，女，研究员研究方向：生化药物的质量控制
Tel / Fax：（010）67095349 E-mail：shenghuayaoshi@ 126. com
对低分子肝素进行糖片段分析，需要将其降解成基本组成单元，目前较为常用的方法为混合肝素酶水解后（肝素酶 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，从肝素黄杆菌中得到），再用高效阴离子交换色谱分析。本实验的原理即用混合肝素酶将依诺肝素钠水解成双糖为主的寡糖片段（表 1），经硼氢化钠还原后，用阴离子交换色谱法进行分析。酶解后的糖链主要生成 4 个含 1，6-脱水衍生物结构的片段：1，6-脱水 ΔⅡS、1，6-脱水 ΔⅡSepi、1，6-脱水 ΔⅠS 和 1，6-脱水 ΔⅠS-ⅠS，酶解后的寡糖由于其 α、β 异构体的存在，双糖 ΔⅡA 与 1，6-脱水 ΔⅡS、1，6-脱水 ΔⅡSepi 不能有效分离，因此酶解后的样品还要经硼氢化钠还原。除 1，6脱水衍生物因含有 1，6 脱水环状结构，不被硼氢化钠还原外，其余寡糖片段还原后消除了互变异构，保留时间会提前，不被硼氢化钠还原的 4 个 1，6-脱水衍生物的保留时间不变，ΔⅡA 与 1，6-脱水 ΔⅡS 和 1，6-脱水 ΔⅡSepi 峰可较好分离（1，6-脱水 ΔⅡS 和 1， 6-脱水 ΔⅡSepi 在目前的色谱条件下会共洗脱，以一个色谱峰的形式被一起定量，为了简化表述，在下文中将不再提及 1，6-脱水 ΔⅡSepi，而以 1，6-脱水 ΔⅡS 表述）。根据各寡糖片段的相对分子质量和峰面积，即可计算出 1，6-脱水衍生物结构的百分含量。