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离子交换色谱技术——分离和纯化生物大分子的必备技术随着人体基因组序列的解读以及各种细胞、组织和器官的高通量技术的发展，对于生命科学研究者而言，研究生物分子、生物大分子和蛋白质化合物的质量和纯度变得越来越重要，以达到提供更准确的实验数据和信息的目的。
因此，从海量混合物中纯化目标化合物的技术在生命科学和制药领域中变得越来越关键。
离子交换色谱技术出现了，它成为了生物大分子分离纯化的必备技术之一。
简介离子交换色谱技术是一种分离和纯化离子型物质的技术，适用于各种蛋白、核酸、多肽以及酶联免疫吸附试验等生物分子的分离与纯化。
其中，“离子交换”指离子交换树脂，是一种高分子化合物，在水中能够形成水合结构。
正负离子交换树脂有阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
在离子交换色谱过程中，该技术通过离子交换柱秉承离子两级的交换作用，从混合物中选择性地移除目标化合物以进行分离和纯化。
离子交换色谱技术的基本原理离子交换色谱技术的基本原理是根据生物大分子表面带有特定电荷的性质，使其与离子交换树脂上的反离子相互作用这种特定的性质相结合。
离子交换树脂本身可以引发这种特定性质，在某些情况下还可以与氢离子或氢氧根离子进行交换。
离子交换柱的结构和工作原理离子交换柱的工作原理是通过离子交换树脂选区性捕捉目标化合物，并通过某些方法从其中释放出来。
离子交换柱由含有离子交换树脂的柱子组成，内部环境包括真空等稳定环境。
离子交换柱根据生物分子在离子交换树脂表面的电荷状态选取不同的离子交换树脂和运行条件。
使用离子交换色谱和高效液相色谱使组分沿着离子交换柱进行分离。
组分的分离可以通过更改溶液中的化学物质来调节离子交换柱上的电位或链的溶解度。
离子交换色谱技术的应用离子交换色谱技术在分别提取多肽药物、血红蛋白和其他蛋白质、核酸序列、酶、低等生物细胞、孔雀石绿和甘草酸等天然产物中都有良好的应用效果。
其中，离子交换柱多用于从血红蛋白、细胞提取物和蛋白质混合物中分离纯化蛋白质，主要分为两个方面。
离子交换色谱摘要：离子交换色谱主要包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。
本文介绍了，离子交换色谱的分离原理，检测方法，淋洗液、色谱柱类型和特点，以及离子交换色谱的应用。
离子色谱（IC）是高效液相色谱（HPLC）的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。
离子色谱的分离机理主要是离子交换，有3种分离方式，它们是高效离子交换色谱（HPIC）、离子排斥色谱（HPIEC）和离子对色谱（MPIC）。
3种分离方式的柱填料的树脂骨架基本都是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物，但树脂的离子交换功能基和容量各不相同。
HPIC 用低容量的离子交换树脂，HPIEC用高容量的树脂，MPIC用不含离子交换基团的多孔树脂。
3种分离方式各基于不同分离机理：HPIC的分离机理主要是离子交换，HPIEC主要为离子排斥，而MPIC则是主要基于吸附和离子对的形成。
离子交换色谱的离子交换分离基于流动相和固定相上的离子交换基团之间发生的离子交换过程。
对高极化度和疏水性较强的离子，分离机理还包括非离子交换的吸附过程。
离子交换色谱主要是用于无机和有机阴离子和阳离子的分离。
离子交换功能基为季铵基的树脂用作为阴离子分离，为磺酸基和羧酸基的树脂作为阳离子分离。
离子交换色谱主要用于分析常见的Cl-，F-，Br-等无机阴离子，有机酸，糖和氨基酸等有机阴离子，分析的阳离子主要是同一元素的多种价态金属阳离子的分离与分析；离子排斥色谱主要用于分离和分析有机酸和无机酸；离子对色谱主要是用于对表面活性剂的分离和分析。
1分离原理离子交换色谱的色谱柱的填料主要由基质（substrate material）和功能基（functional）两部分组成。
功能基是可解离的无机基团，与流动相接触，在固定相表面形成带电荷的离子交换位置，与流动相中的离子发生离子交换，在离子交换反应中，功能基的本体结构不发生明显变化，仅由其离子交换功能基的离子与外界同性电荷的离子发生等量离子交换。
色谱柱填料又被称为“离子交换剂”[1]。
离子交换色谱生物碱离子交换色谱（Ion-exchange Chromatography）是一种常用的分离技术，用于分离和纯化各种带电离子分子，特别是生物碱（alkaloids）和其他电解质。
它是通过静电相互作用原理进行分离，根据分子的电荷和pH条件的差异进行选择性吸附和洗脱。
在离子交换色谱中，离子交换树脂（ionic exchange resin）通常被用作固定相，而溶液（mobile phase）则用来作为洗脱剂。
离子交换色谱的原理是基于离子交换树脂的特性：其表面通常存在着大量的带电离子交换基团。
这些基团能够吸附离子，并与之进行交换。
当样品溶液通过离子交换柱时，带电离子分子被吸附在柱子上，而无电荷分子则通过柱子，从而实现分离。
洗脱过程则通过改变溶液pH或溶液离子强度来实现，将被吸附的分子释放出来。
生物碱是一类广泛存在于植物、动物和微生物中的有机碱性化合物。
它们通常具有生物活性，并在药物、草药和食品等领域具有重要的应用价值。
通过离子交换色谱的分离和纯化，我们可以获得高纯度的生物碱，从而进行结构分析、活性研究和药物开发等工作。
离子交换色谱通常需要根据样品的性质和需求选择合适的离子交换树脂。
离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两类。
阳离子交换树脂通常具有酸性基团，如硫酸基团（sulfonic acid）或羧基团（carboxylic acid），用于吸附带正电荷的物质。
阴离子交换树脂则具有碱性基团，如胺基团（amine）或四甲基胺基团（quaternary amine），用于吸附带负电荷的物质。
在进行离子交换色谱实验时，首先需要准备好离子交换柱。
柱中填充的离子交换树脂将决定分离的选择性和分离效果。
然后，样品溶液会通过柱子，其中带电离子分子会被离子交换树脂吸附下来。
接下来，用洗脱剂冲洗柱子，改变pH或离子强度，将被吸附的分子洗脱出来。
最后，收集洗脱液进行后续分析或进一步处理。
离子交换色谱的优点之一是分离效果好。
离子交换色谱原理离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography, IEC）是一种利用离子交换树脂对离子进行分离的色谱技术。
它是一种广泛应用于生物化学、生物技术和生物医学领域的分离纯化技术，也是一种非常重要的分离手段。
离子交换色谱原理的核心是根据离子在离子交换树脂上的吸附和解吸特性进行分离。
在离子交换色谱中，离子交换树脂是起到分离作用的重要载体。
离子交换树脂是一种聚合物，其表面带有大量的阴离子或阳离子交换基团。
当待分离物质溶液通过离子交换树脂时，树脂上的离子交换基团会与溶液中的离子发生离子交换反应，使得待分离物质中的离子被树脂吸附。
而随着溶液的流动，树脂上的离子交换基团会逐渐释放出被吸附的离子，从而实现了离子的分离。
离子交换色谱原理主要包括两种模式，阴离子交换色谱和阳离子交换色谱。
在阴离子交换色谱中，离子交换树脂上的交换基团带有正电荷，主要用于分离带负电荷的离子，如阴离子。
而在阳离子交换色谱中，离子交换树脂上的交换基团带有负电荷，主要用于分离带正电荷的离子，如阳离子。
这两种模式的选择取决于待分离物质的性质和需要分离的离子种类。
离子交换色谱原理的关键在于选择合适的离子交换树脂以及溶液的pH值。
离子交换树脂的选择应考虑待分离离子的性质，如电荷、大小和亲和力等。
而溶液的pH值则会影响到待分离离子的电荷状态，进而影响到离子在树脂上的吸附和解吸行为。
因此，合理选择离子交换树脂和溶液的pH值是离子交换色谱分离的关键。
离子交换色谱原理的应用非常广泛，特别是在生物医学领域。
它可以用于分离和纯化蛋白质、核酸、多肽等生物大分子，也可以用于分析离子含量和离子组成。
此外，离子交换色谱还常用于水质分析、环境监测和食品安全领域。
它的高分辨率、高灵敏度和高选择性使得离子交换色谱成为一种不可或缺的分析手段。
总的来说，离子交换色谱原理是一种基于离子交换树脂对离子进行分离的色谱技术。
它利用离子交换树脂的吸附和解吸特性，实现了对离子的高效分离。
离子交换色谱原理
离子交换色谱是一种根据离子交换原理进行分离的色谱技术。
其主要原理是利用高分子阴离子或阳离子交换树脂的功能，将溶液中带有弱电荷的离子与交换树脂上的离子发生置换反应，从而实现离子的分离。
在离子交换色谱中，固定相一般采用带有大量阴离子或阳离子功能基团的高分子树脂，该树脂分别被称为阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
样品通过阴离子或阳离子交换树脂时，其中的离子与交换树脂中的对应离子进行竞争吸附，从而实现了离子的分离。
在离子交换色谱中，正常相和反相色谱一样，样品从采样装置进入色谱柱中，经过一系列的洗脱，最终得到可分析和定量的单个或多个离子组分。
在离子交换色谱中，样品中的离子与色谱柱相对应的交换树脂发生置换反应，从而实现分离。
离子交换色谱广泛应用于水质分析、生化分析、环境监测等领域。
离子交换色谱法
离子交换色谱法是一种基于离子交换原理的色谱分析方法。
该方法通过在色谱柱中填充具有不同离子交换基团的离子交换树脂，利用样品中离子与树脂上离子交换基团之间的离子交换作用，将离子分离并进行定量分析。
根据样品中离子的种类和特性，可以选择不同类型的离子交换树脂进行分离，如弱离子交换树脂、强离子交换树脂等。
离子交换色谱法在环境、食品、医药等领域有着广泛的应用，可以分离并定量分析样品中的阳离子、阴离子和中性离子等。
离子交换色谱生物碱
离子交换色谱是一种常用的色谱技术，可以用于分离和纯化生物碱和其他有机化合物。
下面是对离子交换色谱在生物碱分离方面的详细说明：
1. 原理：离子交换色谱主要基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用进行分离。
离子交换剂是一种具有可交换离子基团的树脂，能够与样品中的离子发生交换。
在分离过程中，样品中的离子会根据其带电情况和极性被不同的离子交换剂所吸附，从而实现分离。
2. 实验流程：在生物碱的离子交换色谱分离中，一般会首先将生物碱样品溶解在合适的溶剂中，然后通过输液泵将样品溶液注入色谱柱中。
色谱柱中填装有离子交换剂，样品中的离子会与离子交换剂发生交换，根据不同的带电情况和极性被吸附在不同的位置。
随后，用洗脱液将不同离子洗脱下来，收集各个峰的洗脱液即可得到各个组分。
3. 影响因素：离子交换色谱的分离效果受到多种因素的影响，包括样品的溶解性、离子交换剂的性质、流动相的组成和流速、实验条件等。
其中，样品的溶解性和离子交换剂的性质对分离效果的影响尤为显著。
在实验中需要根据实际情况选择合适的溶剂和离子交换剂，以获得最佳的分离效果。
4. 应用范围：离子交换色谱在生物碱的分离中具有广泛的应用，可以用于分离和纯化各种类型的生物碱，如喹啉类、嘌呤类、有机胺类等。
同时，离子交换色谱还可以用于其他有机化合物的分离和
纯化，如黄酮类、酚类等。
离子交换色谱是一种有效的分离技术，可以用于生物碱和其他有机化合物的分离和纯化。
在实际应用中需要根据实验条件和样品性质选择合适的溶剂和离子交换剂，以获得最佳的分离效果。
第七节 离子交换色谱 离子交换色谱(ion-exchange chromatography，IEC)是发展最早的色谱技术之一。20世纪30年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:①树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在表面，造成有效交换容量很小；②树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性；③树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。 20世纪50年代中期，Sober和Peterson合成了羧甲基(CM-）纤维素和二乙氨乙基（DEAE-）纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交 换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。 一、离子交换色谱相关理论 (一)基本原理 离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图6.7-1所示。 图6.7-1 离子交换色谱原理 起始缓冲液中的离子； 梯度缓冲液中的离子； 极限缓冲液中的离子； 待分离的目标分子；▲ 需除去的杂质 1- 上样阶段，此时离子交换剂与平衡离子结合；2- 吸附阶段，混合样品中的分子与离子交换剂结合；3- 开始解吸阶段，杂质分子与离子交换剂之间结合较弱而先被洗脱，目标分子仍处于吸附状态；4- 完全解吸阶段，目标分子被洗脱；5- 再生阶段，用起始缓冲液重新平衡色谱柱，以备下次使用 蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化，即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。 (二)基本理论 1 . 离子交换作用 离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子(包括缓冲液中的离子、蛋白质形成的离子)依靠静电引力能够吸附在其表面(如图6.7-2所示)。这样，各种离子与离子交换剂结合时存在竞争关系。 无机离子与交换剂的结合能力与离子所带电荷成正比，与该离子形成的水合离子半径成反比。也就是说，离子的价态越高，结合力越强；价态相同时，原子序数越高，结合力越强。在阳离子交换剂上，常见离子结合力强弱顺序为：Li+图6.7-2离子交换色潜中所进行的离子 交换过程(以阳离子交换树脂为例) 在阴离子交换剂上，结合力强弱顺序为：F—— 目的物与离子交换剂的结合能力首先取决于溶液pH，它决定了目的物的带电状态，此外还取决于溶液中离子的种类和离子强度。起始条件，溶液中离子强度较低，上样后，目的物与交换剂之间结合能力更强，能取代离子而吸附到交换剂上;洗脱时，往往通过提高溶液的离子强度，增加了离子的竞争性结合能.力，使得样品从交换剂上解吸，这就是离子交换色谱的本质。 2. pH和离子强度I的影响 pH和离子强度I是控制蛋白质离子交换行为、分辨率、回收率等的重要因素。 pH决定了目标分子及离子交换剂的带电荷情况，因而是决定目的物是否发生吸附的最重要参数。分离时，应控制pH使得目标分子和离子交换剂带相反的电荷。一方面，离子交换剂有一个工作pH范围，在此范围内能够确保离子交换剂带充足的电荷；另一方面，溶液的pH直接决定了目标分子带电荷的种类和数量，选择适当的pH，能够保证目标分子与离子交换剂带相反电荷而被吸附，同时如果pH距离目标分子等电点过远，则造成目标分子与离子交换剂结合过于牢固而不易洗脱。 在选择操作pH时还需特别注意目标分子的pH稳定范围，若超出此范围会造成目标分子活性丧失，导致回收率下降。特别是要考虑到由于道南效应( Donnan）的存在，离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的，离子交换剂是亲水的，其表面有一层水膜，水膜里可以看作是离子交换剂的微环境。在阳离子交换剂表面的微环境中，H+被阳离子交换基团吸引而OH—被排斥，造成交换剂表面pH比周围缓冲液中低1个pH单位；而阴离子交换剂表面的微环境中，OH—被阴离子交换基团吸引而H+被排斥，造成交换剂表面pH比周围缓冲液中高1个pH单位。例如，某蛋白质在pH5时被阳离子交换剂吸附，实际上该蛋白质在交换剂表面是处在pH4的环境中，若此蛋白质在此pH条件下不稳定将会失活。大多数蛋白质在 pH4以下稳定性都会下降而使回收率很低。 由于溶液中的其他离子与目标分子竞争结合到离子交换剂上，因此离子种类和离子强度I是影响月标分子结合和洗脱的另一重要因素。低离子强度下，目标分子通过荷电基团结合至离子交换剂上带相反电荷的功能基团上;当竞争离子浓度即离子强度I逐渐升高时，目标分子逐渐被置换下来。绝大多数目的物在1mol/L的盐浓度下能够被洗脱，因此在探索条件阶段，人们常把洗脱盐的终浓度定为1mo1/L。事实上在溶液中盐类还常扮演稳定目的物结构的角色，另外，不同离子从交换剂上将目的物置换下来的能力是不同的，并且离子类型还会对分辨率和不同蛋白质的洗脱顺序产生影响。 3. 疏水相互作用和氢键 虽然目的物与离子交换剂发生结合主要依靠相反电荷之间的离子键，但实际上此过程中还可能存在其他的作用力，常见的就是疏水相互作用和氢键。 疏水相互作用主要出现在使用带非极性骨架的离子交换剂时，例如离子交换树脂，特别是聚苯乙烯树脂，骨架带有较强的疏水性，能与目的物分子中的一些疏水性氨基酸残基之间通过疏水相互作用结合。现代HPLC中仍有部分色谱介质以树脂为骨架。氢键主要出现在使用以亲水性高分子为骨架的离子交换剂，如以Sephadex或Sepharose为基质的离子交换剂，骨架糖链中的轻基、羧基等基团能够与目的物分子中带亲水侧链的氨基酸残基之间形成氢键。当目的物与杂质在电性质方面很接近时，这些额外的作用力在分离时起着决定性的作用，据此往往可实现分离。 4. 离子交换动力学 离子交换的发生及进行的程度即离了交换平衡取决于离子作用，而离子交换动力学则取决于离子交换剂的颗粒结构。 离子交换剂的骨架是具有网孔状结构的颗粒状凝胶，而荷电功能基团均匀分布在凝胶颗粒的表面及网孔内部，可交换分子依据分子量的不同，不同程度地进人凝胶颗粒内部，将荷电功能基团上的反离子置换下来而自身结合到离子交换剂上。 从动力学角度分析，整个过程可分为5个步骤(图6.7-3）。①可交换分子在溶液中经扩散到达凝胶颗粒表面。亲水性的凝胶和水分子形成氢键，从而在凝胶表面束缚了一层结合水构成水膜，水膜的厚度取决于凝胶的亲水性强弱、色谱时流速的快慢，亲水性越强、流速越慢，水膜越厚，反之水膜越薄。可交换分子通过扩散穿过水膜到达凝胶表面的过程称为膜扩散，速度取决于水膜两侧可交换分子的浓度差。②可交换分子进入凝胶颗粒网孔，并到达发生交换的位置，此过程称为粒子扩散，其速度取决于凝胶颗粒网孔大小(交联度)、交换剂功能基团种类、可交换分子大小和带电荷数等多种因素。③可交换分子取代交换剂上的反离于
图6.7-3 离子交换动力学示意 (以阳离子交换剂为例) 而发生离于交换。④被置换下来的反离子扩散到达凝胶颗粒表面，也即粒子扩散，方向与步骤②相反。⑤反离子通过扩散穿过水膜到达溶液中，即膜扩散，方向与步骤①相反。 根据电荷平衡的原则，一定时间内，一个带电分子进人凝胶颗粒，就有与该分子所带净电荷数相当数量的反离子扩散出凝胶颗粒。上述5个步骤实际上就是膜扩散、粒子扩散和交换反应3个过程。其中交换反应通常速率比较快，而膜扩散和粒子扩散速率较慢，当溶液中可交换分子浓度较低时，膜扩散过程往往最慢而成为整个过程的限制性步骤；当溶液中可交换分子浓度较高时，粒子扩散过程往往最慢而成为整个过程的限制性步骤。灌注色谱动力学角度分析，就是通过独有的二元孔网络结构，可使粒子扩散速率大大提高，从而使整个过程效率提高。 (三) 离子交换的分辨率 同其他色谱分离一样，离子交换的效果常用两个目标峰的分辨率(Rs)来描述。 一个纯化系统能够达到的分辨率取决于该系统的选择性、效率和容量，这是柱色谱中的3个最重要的参数。Rs的解析表达式为:
k1ka1-a41sNR （6.7-1）
式中 a ——选择性 N ——柱效率 k＇——容量因子 1. 容量因子 容量因子k＇又称保留因子，是色谱分离中常用的组分保留值表示法。
0000/t/ttkVVVRR）（ （6.7-2）
式中 tR和VR——溶质的保留时间和保留体积 t0和V0——非滞留组分的保留时间和保留体积 一般来说，容量因子k＇的取值与可交换分子在固定相(离子交换剂)和流动相(缓冲液)中的分配性质、色谱温度及固定相和流动相的体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。 2. 柱效率 柱效率用在特定实验条件下色谱柱的理论塔板数N来表示，通常表示为每米色谱床所包含的理论塔板数，其计算公式: 2
h54.5WVNR （6.7-3）
式中 VR——洗脱峰的洗脱体积 Wh——洗脱峰半峰高（h1/2）时对应的峰宽 柱效率下降会导致色谱时区带变宽，也就是洗脱峰的峰宽变大口导致区带变宽的原因之一是可交换分子在色谱柱床中发生纵向扩散，采用尺寸较小的凝胶颗粒作为离子交换剂的基质，可有效减小能够发生纵向扩散的距离，从而大大提高柱效率。现代离子交换色谱介质中有些是以很小的颗粒作为基质的(小于3µm），它们有非常高的柱效率，但它们往往是非孔型的，可交换分子只能结合在其表面，因而此种离子交换剂的交换容量会下降。另外，随着基质颗粒的减小，色谱分离时产生的背景压力会增大，不利于进行快速、大规模的色谱。除基质颗粒大小外，实验技术是影响柱效率的另一重要因素，色谱柱床面不平整，柱床内有气泡等都
