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黑曲霉固态发酵产纤维素酶条件优化及秸秆糖化研究黑曲霉固态发酵产纤维素酶条件优化及秸秆糖化研究摘要：纤维素酶在生物能源领域中扮演着重要角色，能够有效降解秸秆等废弃物，并转化为发酵产物，如生物乙醇。
本研究通过固态发酵的方式培养黑曲霉，优化产纤维素酶的条件，并利用优化的酶解液对秸秆进行糖化实验，探究最佳的糖化条件。
关键词：黑曲霉；固态发酵；纤维素酶；秸秆糖化1. 引言随着能源危机的严峻形势和环境问题的日益突出，生物质能源作为一种可再生、环境友好的能源逐渐受到人们的关注。
秸秆作为生物质资源的一种，具有庞大的潜在能量价值，但其利用率低下。
纤维素作为秸秆主要成分之一，具有较高的结晶度和难以降解的特点，传统的物理、化学方法不能有效降解纤维素。
2. 方法及实验步骤2.1 培养黑曲霉产生纤维素酶选择黑曲霉作为研究对象，进行固态发酵培养。
黑曲霉菌种接种于固态培养基中，控制温度、湿度等条件。
根据黑曲霉固态发酵产酶曲线，确定最佳培养时间和培养温度。
2.2 优化产纤维素酶的条件通过单因素实验以及响应面试验，探究培养基配方、碳源浓度、氮源浓度、pH值等因素对纤维素酶产量的影响。
通过分析实验数据，确定最佳的产酶条件。
2.3 秸秆糖化实验利用优化的纤维素酶酶解液对秸秆进行糖化实验。
调整酶解液的酶解时间、温度和pH值等参数，探究最佳的糖化条件。
通过测定糖化液中的还原糖含量，评估糖化效果。
3. 结果与讨论3.1 产纤维素酶的固态发酵条件优化在黑曲霉固态发酵条件下，最佳培养时间为7天，最佳培养温度为32℃。
该条件下，纤维素酶的产量达到最高。
3.2 产纤维素酶的条件优化通过单因素实验和响应面试验优化产纤维素酶的条件，得到最佳培养基配方为：碳源浓度5g/L，氮源浓度4g/L，pH值5.5。
3.3 秸秆糖化效果评估在最佳糖化条件下，糖化液中的还原糖含量达到最高值，说明纤维素酶能够有效降解秸秆中的纤维素，释放出糖分。
4. 结论通过本次研究，确定了黑曲霉固态发酵产纤维素酶的最佳条件，并利用优化的纤维素酶对秸秆进行糖化实验，证实了纤维素酶能够有效降解秸秆中的纤维素。
第8期（总第380期）2021年8月No.8 AUG文章编号：1673-887X(2021)08-0072-03黑曲霉产纤维素酶的研究进展周艳华，张春艳（长沙环境保护职业技术学院，湖南长沙410004）摘要黑曲霉是公认的安全菌株，因其无毒而受到工业界的青睐，利用黑曲霉生产纤维素酶已成为近年来的研究热点。
文章主要对黑曲霉产纤维素酶发酵方法的研究现状进行了综述。
关键词黑曲霉；纤维素酶；固体发酵法；液体发酵法中图分类号TQ925文献标志码A doi:10.3969/j.issn.1673-887X.2021.08.031Research Progress on Cellulase Produced by Aspergillus NigerZhou Yanhua,Zhang Chunyan(Changsha Environmental Protection Vocational College,Changsha410004,Hunan,China)Abstract：Aspergillus niger is a recognized safe strain.It is favored by the industry because of its non-toxicity.The use of Aspergil‐lus niger to produce cellulase has become a research focus in recent years.This article mainly reviews the research status of the fer‐mentation method of Aspergillus niger to produce cellulase.Key words：Aspergillus niger,cellulase,solid fermentation method,liquid fermentation method纤维素是植物细胞壁的主要成分，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，其基本结构是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的纤维二糖[1]。
黑曲霉发酵产酶研究进展张熙;韩双艳【摘要】黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属真菌中的常见种,它生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素,是美国FDA认证安全菌种(GRAS)之一,也是重要的酶制剂生产菌种.综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展,并展望了其广阔的应用前景.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2016(033)001【总页数】4页(P13-16)【关键词】黑曲霉;酶;发酵产酶【作者】张熙;韩双艳【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q939.97黑曲霉(Aspergillus niger)，属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科，是丝状真菌的一个常见种，广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。
人类运用黑曲霉的历史悠久，早在中国古代，人们就利用黑曲霉制作酱料、酱油、米酒等。
由于黑曲霉生长旺盛、发酵周期短、不产生毒素，被美国FDA认证为安全菌种(GRAS)。
黑曲霉具有很强的外源基因表达能力及高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，同时重组子具有很高的遗传稳定性。
随着越来越多的外源蛋白在黑曲霉成功表达，且被证明具有较高的产量和活性，黑曲霉成为了一个重要的酶表达体系，也逐渐成为重要的工业酶制剂生产菌种[1]。
据报道，黑曲霉可生产纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、果胶酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多种酶。
作者综述了黑曲霉产纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的研究进展，并展望了其广阔的应用前景。
纤维素是地球上分布最广泛的一类碳水化合物，也是最丰富的可再生资源，但因其结构复杂、降解难度大，还未实现有效的转化利用。
纤维素酶由葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)、β-葡萄糖苷酶(β-BG)构成[2]，主要用于水解纤维素的β-1,4葡萄糖苷键，使纤维素分解成短链糖。
海洋黑曲霉固态发酵耐盐纤维素酶的培养条件优化及粗酶制剂的制备纤维素酶是降解纤维素的一组酶系总称,其主要由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶组成。
纤维素降解后可产生经济、丰富的生产原料,且有望解决自然界中不断产生的固体废物问题。
本文将从固态发酵技术的优化、纤维素酶提取工艺的比较、在固态与液态发酵条件下丹宁-PEG提取工艺的研究及适应性、浓缩液真空冷冻干燥形成粗酶制剂等几个方面来探讨纤维素酶的生产问题,主要研究内容及结果如下:在单因素条件下,确定了以麸皮:玉米秸秆(1:1)作为混合碳源,氯化铵作为氮源、含水量70%作为培养基。
利用Plackett-Burman设计筛选出影响滤纸酶活力的显著因素:含水量、起始pH值。
将显著因子通过最陡爬坡试验逼近最大酶活力区域。
最后用Box-Behnken响应面分析确定了浅盘固态发酵产酶的最优培养条件:玉米秸秆 48.53%、麸皮48.53%、NH4Cl1.94%、KH2PO40.2%、Fe(OH)30.16%、料水比为1:2.2、接种量2%、初始pH4.28、装液量30g,置于温度为280C的培养箱中培养7天。
将培养基样品溶解在10倍体积的自来水中,于200C摇床浸提1 h,得到实验优化后的滤纸酶活达到了 14.826U/g,比优化前提高了 75.12%。
将固体发酵得到的粗酶液进行纤维素酶提取。
探究丹宁-聚乙二醇(PEG)沉淀在固态发酵条件下的工艺。
结果表明:丹宁浓度12 mg/mL、丹宁沉淀静置时间为70min时,纤维素酶沉淀率最高。
PEG提取效果优于PVP,在PEG浓度为30mg/mL、静置时间10min下,对沉淀进行复溶,其纤维素酶回收率为96.97%,浓缩倍数为10。
比较了丹宁-PEG沉淀、硫酸铵沉淀、超滤的浓缩效果,发现硫酸铵沉淀、超滤和丹宁-PEG沉淀均可达到一定的浓缩程度,但存在差异:硫酸铵用量大、酶活损失比较大;超滤浓缩耗时长、且膜易污染、易形成浓差极化;丹宁-PEG方便、快捷、易操作,但是成本也将是不容忽视的问题。
黑曲霉发酵生产纤维素酶实验一、实验目的1、了解纤维素酶的生产工艺和原理2、掌握液体发酵和固体发酵工艺3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理二、实验原理纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。
高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。
纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。
以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。
还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。
三、材料与试剂配制1、生产菌种：黑曲霉2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。
3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2O = 7.0 g/L ;NH4NO3= 1 g/L ;KCl= 0.7 g/ L ; NaH2PO4= 2.0 g/ L ;Na2HPO4=3.0 g/ L ,pH7.4。
4、微量元素液：FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L，ZnSO4· 7H2O 1.4mg/L，CoCl22.0mg/L，加蒸馏水200ml使之溶解。
5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源 3 g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g，蛋白胨0.05g作有机氮源，人工海水100 ml（含1%微量元素液），自然pH值。
6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5 g，人工海水12 ml（含1%微量元素液，1%氯化铵或硫酸铵，0.05%蛋白胨），自然pH值。
7、6% DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500ml水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g，20.8gNaOH,5g苯酚，5g无水亚硫酸钠，加热搅拌溶解，冷却后定容至1000ml。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展【摘要】本文主要介绍了产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究进展。
首先解释了纤维素酶的作用与应用，然后介绍了不同种类产纤维素酶菌的特点以及筛选方法。
接着讨论了如何改良产纤维素酶菌的培养条件和优化生产工艺。
最后分析了研究的重要性，探讨了未来研究方向，并进行总结。
通过本文的介绍，读者可以了解到产纤维素酶菌及其改良方法在生物工程领域的重要性和潜在应用，为相关领域的研究提供了启示和指导。
【关键词】产纤维素酶菌、筛选、改良、纤维素酶、菌种、特点、培养条件、生产工艺、研究进展、重要性、未来方向、总结。
1. 引言1.1 产纤维素酶菌及其筛选改良方法研究进展产纤维素酶是一类能够降解纤维素的酶，能够将纤维素分解成可利用的小分子糖类，具有重要的应用价值。
随着生物技术的发展，人们对产纤维素酶菌及其筛选改良方法进行了深入研究，取得了一系列进展。
产纤维素酶菌是产生纤维素酶的微生物，包括细菌、真菌和放线菌等。
不同种类的产纤维素酶菌具有不同的特点，如生长速度、纤维素酶产量和适应环境等。
筛选出高效的产纤维素酶菌对于提高纤维素降解效率至关重要。
在筛选产纤维素酶菌的过程中，常采用的方法包括传统的筛选培养基、色谱技术、PCR技术等。
通过这些方法，可以快速有效地筛选出具有高产酶能力的菌株，为纤维素降解的研究和应用提供了有效的渠道。
改良产纤维素酶菌的培养条件也是提高纤维素酶产量的重要途径。
调节温度、pH值、碳源和氮源等因素，可以显著提高产酶菌株的酶活力和产酶量。
在优化产纤维素酶的生产工艺方面，通过对发酵过程中各项参数的精细调控，可以大幅提升纤维素酶的产量和活力，实现经济效益和环境友好的纤维素降解过程。
产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究对于开发和利用纤维素资源具有重要意义。
未来的研究方向应该围绕提高产纤维素酶菌的酶活力、稳定性和产酶量展开，以满足不断增长的纤维素降解需求。
通过不懈的努力和创新，相信产纤维素酶菌及其筛选改良方法的研究将迎来更加美好的发展前景。
黑曲霉AF-98固体发酵产纤维素酶的产酶条件研究
黑曲霉AF-98固体发酵产纤维素酶的产酶条件研究
通过单因子及正交试验,对黑曲霉AF-98固体发酵产纤维素酶的产酶条件进行了探讨.其优化的产酶条件为:甘蔗渣3g,麸皮2g,加含尿素为0.15%的Mandels营养液25mL(加水比1:5),调初始pH5.0,28℃发酵72h.在此优化条件下,纤维素酶活力可达7.56u/g干曲.
作者：伍红陆兆新吕玫徐源 WU Hong LU Zhao-Xin LU Mei XU Yuan 作者单位：伍红,WU Hong(西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041)
陆兆新,吕玫,徐源,LU Zhao-Xin,LU Mei,XU Yuan(南京农业大学食品科技学院,南京,210095)
刊名：菌物学报 ISTIC PKU 英文刊名： MYCOSYSTEMA 年，卷(期)： 2006 25(3) 分类号： Q94 关键词：真菌单因子试验培养条件优化麸皮。
论产纤维素酶黑曲霉菌的探究进展作为地球上含量最为丰富，分布最为广泛的可再生生物质资源，纤维素的开发与利用对于解决能源危机、环境污染、粮食资源紧张等问题意义重大。
纤维素由D - 葡萄糖分子以beta; - 1，4 糖苷键组成的大分子多糖，其分子结构结晶度与聚合度高，需要利用纤维素酶的水解作用，将其降解成为单糖，继而进行纤维素的合理利用与转化。
纤维素酶是一组复合酶系，通过多种酶的协同作用水解降解纤维素，纤维素酶主要来源于可产纤维素酶的细菌和真菌。
其中，由于丝状真菌纤维素酶产量高于细菌和酵母菌等真菌，被广泛应用于纤维素酶产业化生产。
作为丝状真菌中的一员，黑曲霉菌高产纤维素酶，且安全、无毒素，在产纤维素酶微生物研究领域，黑曲霉菌是开发、利用最为广泛的真菌之一。
近年来，在高产纤维素酶微生物，发酵产酶工艺，应用领域等方面国内外均开展了相关研究，且取得了一定的进展。
1 纤维素酶的组成与催化机制
纤维素酶是由三种不同酶组成的复合酶系，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或纤维二塘水解酶、beta; - 葡萄糖苷酶。
三种酶通过协同作用将纤维素降解为寡糖和纤维二塘，并最终水解为葡萄糖。
内切葡聚糖酶主要作用于纤维素分子的非结晶区，随机水解beta; - 1，
4 糖苷键并产生大量带有非还原末端的小分子纤维，此外，也能水解纤维素的某些基团取代产物，如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素等。
外切葡聚糖酶主要作用于微晶纤维素分子的还原端和非还原端，水解beta; - 1，4 糖苷键，从而裂解下二糖分子。
beta; - 葡萄糖苷酶可将纤维二糖和其他可溶性寡糖水解为葡萄糖。
2 产纤维素酶微生物
产纤维素酶的微生物主要包括细菌、真菌和放线菌。
放线菌和细菌纤维素酶产量相对较低，放线菌生长缓慢，相关研究较少，细菌纤维素酶多为内切葡聚糖酶，对结晶纤维素无活性，且分离难度较大，影响其产业化开发。
高产纤维素酶的真菌主要包括曲霉菌属、木霉菌属、青霉菌属、镰孢菌属和枝顶孢雄属等。
其中，丝状真菌是纤维素酶产业化开发与利用的首选微生物。
曲霉菌属是丝状真菌中著名的高产纤维素酶菌属之一，而作为曲霉菌属中的一员，黑曲霉菌除高产纤维素酶外，还能合成木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、alpha; - 半乳糖苷酶、beta; - 葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶、蛋白酶等酶，可促进生物质的高效降解，且安全、无毒素，其研究与产业化开发也较为广泛。
3 黑曲霉菌产酶工艺与影响因素
由于黑曲霉菌需在低含水量固态发酵底物中生长、传代，其生产
纤维素酶工艺通常采用固体发酵法。
固体发酵法的最大优点是可以利用木质纤维素废弃物作为发酵底物，且固体发酵法提供的生长环境与黑曲霉菌的天然生长环境相似，更有利于其生长、传代。
此外，固体发酵法还具备成本低，工艺简单，酶产物回收率高，能源需求低，污水排放少等优点。
主要缺点是发酵过程中温度、pH、营养成分含量等工艺条件的控制与监测较为复杂与困难。
另外，国外也有学者改良了黑曲霉菌发酵产酶工艺，Cunha 等选用黑曲霉菌为生产菌，甘蔗废弃物为发酵底物，应用固液连续发酵法生产纤维素酶，研究结果表明，应用固液连续发酵法获得内切葡聚糖酶和木聚糖酶产量高于传统的固体发酵法。
黑曲霉菌纤维素酶产量受到多种因素影响，主要包括发酵培养工艺，产酶诱导因子，菌株产酶效率，发酵设备生产效率等均可影响黑曲霉菌的生长状态，从而影响其酶合成量。
其中，发酵培养条件( 如pH、温度、培养基氮源、碳源、阳离子等) 可通过优化实验改良。
在固体发酵底物中添加不同种类的纤维素和木质素，乳糖等诱导因子，可在一定程度上诱导黑曲霉菌提高纤维素酶产量。
4 产纤维素酶黑曲霉菌应用研究
黑曲霉菌高产纤维素酶，在乙醇等生物燃料开发领域具有一定应用前景。
此外，在食品加工，木质纤维素废弃物降解，动物饲料添加
剂等领域也取得了相关研究进展。
4. 1 生物燃料
2010 年我国可收集秸秆资源量约为7 亿t，加上工业和林业纤维废弃物，每年木质纤维素资源总量将超过20 亿t。
产纤维素黑曲霉菌可将农作物的秸秆、工业和林业纤维废弃物等木质纤维素原料水解为葡萄糖，用于生产乙醇、有机酸和其他化学制品，从而缓解人们对矿物燃料的依赖。
Bjorn 等将甘蔗渣和云杉木水解液作为发酵底物，研究了重组黑曲霉菌D15 菌株的产酶特性，结果表明，重组黑曲霉菌D15 不仅可降解木质纤维素，还可降解和转化其衍生物，如乙酸、呋喃醛、紫锥菊多酚等，有利于酵母菌乙醇发酵，从而促进以木质纤维素生物质为原料第二代生物乙醇工厂的发展。
4. 2 食品加工
在保健食品、果汁和蔬菜汁加工和茶叶加工等领域，国内外学者报道了相关研究。
Dhillon 等选用苹果酱、稻壳、藜芦醇、硫酸铜、乳糖等原料配制固体发酵培养基，研究了黑曲霉菌NRRL - 567 纤维素酶粗提液中非特异性壳多糖酶和壳聚糖酶的活性，壳多糖酶和壳聚糖酶活性分别达到了70. 28 U/g 和64. 20 U/g，且保存1 个月后酶活性仍达到92% ～94%。
高壳多糖酶和壳聚糖酶活性的黑曲霉菌纤维素酶提取液，可用于生产低分子量壳多糖和壳聚糖低聚体。
在保健食品
生产方面具有重要的用途。
Ajay等从黑曲霉菌DFR - 5 酶液中提纯木聚糖酶，并研究了木聚糖酶与果胶酶和纤维素酶混合物对菠萝汁产量和澄清度的影响。
与对照组相比，木聚糖酶试验组菠萝汁的生产率和澄清度分别达到了71. 3% 和64. 7%，均高于对照组( 61. 8% 和57. 8%) 。
结果表明，黑曲霉菌木聚糖酶提取液可用于提高果汁澄清度，在果汁和蔬菜汁加工领域具有一定的应用前景。
另外，在茶叶加工领域，黑曲霉菌是普洱茶发酵过程中的优势菌，通过合成多种酶类，促进酚类物质、纤维素、果胶、蛋白质等物质的分解，可一定程度上改善茶叶感官特性，缩短加工时间，提高茶叶品质。
4. 3 木质纤维素废弃物降解
纤维素类城市固体废弃物作为一类可再生生物质，其资源量巨大，可用于生产纤维素酶，Gautam等选用城市固体废弃物作为碳源，研究了黑曲霉菌和木霉菌纤维素酶活，固体废弃物、蛋白胨、酵母提取液为最理想的碳源和氮源，黑曲霉菌和木霉菌培养物中酶的总量比其他真菌高40% ～60%。
结果表明，纤维素类城市固体废弃物作为一种碳源，可由黑曲霉菌和木霉菌降解、利用。
此外，黑曲霉菌还可降解农作物秸秆、甘蔗渣、椰壳废弃物等纤维素废弃物资源，合成纤维素酶，变废为宝，从而减少资源浪费，降低环境污染。
4. 4 动物饲料添加剂
由于黑曲霉菌安全，无毒素，且高产纤维素酶，在动物饲料添加剂研究与应用领域，已引起国内外学者的关注。
Chandra 等分别以牛落花生饲草、麦麸、米糠、锯屑等木质纤维素作为固体发酵底物，研究了黑曲霉菌滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和葡萄糖苷酶酶活，比较了各种底物发酵前后蛋白含量。
其中，黑曲霉菌发酵落花生饲草和麦麸底物后滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、beta; - 葡萄糖苷酶酶均显著高于其他实验组。
此外，发酵后的牛落花生饲草蛋白含量有所提高。
结果表明，黑曲霉菌可发酵牛落花生饲草、麦麸等木质纤维素合成纤维素酶，且提高了牛落花生饲草营养价值。
张福元等研究了黑曲霉发酵玉米秸秆产纤维素酶及降解基质的营养条件，优化营养条件后可使黑曲霉菌株产CMCase、FPase 酶活性达到最高。
此外，经黑曲霉菌发酵后，玉米秸秆粗蛋白含量提高了1. 2 倍，粗纤维、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量分别下降了34%、19%、23%。
结果表明，黑曲霉菌可发酵玉米秸秆合成纤维素酶，且提高了玉米秸秆营养价值，为玉米秸秆青贮、黄贮发酵饲料的产业化开发和应用提供了科学依据。
5 小结
纤维素资源产量巨大，纤维素类废弃物也日渐增多，科学、高效降解纤维素类生物质资源，促进其可循环利用可在一定程度上减少资源浪费，降低环境污染。
纤维素酶可高效降解纤维素，然而，降解纤
维素耗酶量巨大，如何提高纤维酶产量是关键。
微生物发酵是纤维素酶产业化生产的有效途径，可研究、选育高产纤维素酶菌株进行生物发酵产酶。
随着微生物学、生物化学，生物遗传学，基因工程学等学科的不断发展，应进一步开展高产纤维素酶黑曲霉菌菌株选育，发酵产酶工艺优化，纤维素酶生物活性与作用机制等研究，提高纤维素酶活，缩短加工时间，降低生产成本，从而促进产纤维素黑曲霉菌的产业化开发与利用。
