RF-5301PC荧光分光光度计使用

荧光分光光度计使用操作注意事项光度计操作规程荧光分光光度计也被称作（荧光光谱仪），是一款利用惰性气体氩气作载气，将气态氢化物和过量氢气与载气混合后，导入加热的原子装扮置。

原子荧光光谱分析法具有设备简单、灵敏度高、光谱干扰少、工作曲线线性范围宽、可以进行多元素测定等优点。

在地质、冶金、石油、生物医学、地球化学、材料和环境科学等各个领域内获得了广泛的应用。

作为一款专业测量分析物质的设备，为避开荧光光谱仪在使用过程中显现分析误差，需要注意以下几点：1.在打开荧光光谱仪的主机之前，需要调整其设备各性能数值，比如需要先开氩气钢瓶总阀并将出口压力调至规范区域内，否则会导致仪器欠压报警并对荧光光谱仪的正常工作造成影响。

2.需要安装需测的元素灯，再打开仪器，开启设备后等仪器自检结束，再检查看元素灯有没有亮，然后取下排风罩，将调光器放在原子化器上，旋转元素灯座的可调螺钉，调整元素灯光斑中心至对光器横线与竖线的交叉点，便完成对元素灯的安装调整。

3.在使用荧光光谱仪的过程中应保持试验室通风情形良好，并对废液桶进行适时处理，以保持废液排放正常。

4.在荧光光谱仪完成测试后，需要对其进行适时清理，避开因残留异物导致下次检测显现错误。

5.在对荧光光谱仪清洁完后，依照规定操作对各开关进行关闭，并进行相应的存放操作。

6.定期对荧光光谱仪进行检修保养，适时清洁荧光光谱仪中的异物，避开其对设备造成损坏。

由于资料有限，因而上述（荧光光谱仪）操作注意事项并不全面，在实际进行操作的过程中，建议咨询相关专业技术人员，并查阅相应使用说明书。

原子吸取分光光度计有效的样品处理技术原子吸取分光光度计样品要被吸喷雾化后才能被分析，为了使测量的结果有代表性，必需要保证样品均匀的分布在溶液中。

所以有很多样品必需要经过前处理才能拿来测定，而不同的样品有不同的前处理方法，同一样品也有多种的前处理方法，选择不同方法的依据就是便利快捷、同时又要尽量削减样品的用量，削减有效成分的流失。

一、设备名称：RF-5301PC荧光分光光度计；二、使用原理1、荧光分光光度计由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。

荧光是光致发光，任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱，发射波长总是大于激发波长。

荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。

荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。

由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。

有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。

在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。

利用某些物质受激发出的荧光，其光强度与该物质的含量成一定函数关系的性质而制成的。

三、组成结构光源、光件、样品池、检测器、数据处理器1、荧光分光光度计图RF5301PC荧光分光光度计主要是由激发光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器以及数据处理系统几部分组成1. 光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。

2．激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。

3．发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。

筛选出特定的发射光谱。

4．样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。

测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。

工作原理荧光产生的原理荧光的定义：某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的光。

荧光产生的原理：化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能等)而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射(即发光)。

荧光化合物的两种特征光谱1. 荧光激发光谱，就是通过测量荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，它反映了不同波长激发光引起荧光的相对效率。

2. 荧光发射光谱，如使激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质所产生的荧光通过发射单色器后照射于检测器上，扫描发射单色器并检测各种波长下相应的荧光强度，然后通过记录仪记录荧光强度对发射波长的关系曲线，所得到的谱图称为荧光光谱。

物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。

当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。

荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高，浓度太大的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。

荧光发射的特点：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光;而一旦停止供能，发光(荧光)现象也随之在瞬间内消失。

溶液荧光光谱通常具有的特征：(1) 斯托克斯位移：在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长。

(2) 荧光发射光谱的形状与激发波长无关。

(3) 荧光发射光谱的形成与吸收光谱的形状有镜像关系荧光的猝灭：荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。

一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。

因此荧光物质的保存应注意避免光(特别是紫外光)的直接照射和与其他化合物的接触。

荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。

分光光度计的使用方法主体内容：1．使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理。

以及各个操作旋钮之功能。

在未接通电源前，应该对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固。

通地要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源开关。

仪器在使用前先检查一下，放大器暗盒的硅胶干燥筒（在仪器的左侧），如受潮变色，应更换干燥的蓝色硅胶或者倒出原硅胶，烘干后再用。

2．将灵敏度旋钮调置“1”档（放大倍率最小)。

3．开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调至测试用波长。

仪器预热20分钟。

4．打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00。

0”，盖上试样室盖，将比色皿架置与蒸馏水校正位置，使光电管受光,调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”.5．如果显示不到“100。

0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能置低倍率档使用,这样仪器将有更高的稳定性。

但改变倍率后必须按(4）重新校正“0”和“100％”。

6．预热后，按(4)连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作.7．吸光度A的测量按(4)调整仪器的“00。

0"和“100%”,将选择开关置于“A”,调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000",然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。

8．浓度C的测量:选择开关由“A"旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值.9．如果大幅度改变测试波长时，在调整“0"和“100%"后稍等片刻，（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间)，当稳定后，重新调整“0”和“100％”即可工作.10．每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单个调换。

11．本仪器数字表后盖，有信号输出0～1000MV，插座1脚为正，2脚为负接地线。

荧光分光光度计操作规程
一、开机
1、确保分光光度计与个人电脑是通过随机配带的USB数据线连接
2、将电脑打开，打开荧光分光光度计的电源开关。

3、检查表示氙灯是否被点着及仪器处于工作状态的批示灯是亮的。

4、双击桌面上荧光分析软件快捷图标。

5、等待程序初始化，系统将自检，如果出现错误提示，立即关闭荧光分光光度计，过15
分钟再重新启动。

二、关机
1、选择文件菜单里的“关闭”命令，点击“是”终止联机。

2、出现是否关机的图示，点击“是”关灯并退出荧光分析软件。

3、等氙灯充分冷却后再关荧光分光光度计。

三、操作
1、创建一个分析方法
从工具菜单中，选择配置命令来设置分析条件。

扫描类型选择波长扫描，根据标准再设定扫描模式、数据模式、发射波长、激发波长等参数。

2、测量样品
选择好测量方法后，进入波长测量界面，将样品入入指定的样品槽，点击菜单工具－扫描进行测量或点击扫描按钮进行测量，如果中途暂停测量，点击工具条上的停止按钮。

扫描完毕后，图谱处理窗口或打印窗口将会自动弹出。

峰值表将显示峰数、峰的起始位置、峰的终止位置、峰高值、谷位置、谷值、半峰宽等信息。

3、谱图处理
对样品和标准按照同样的方法进行处理，并对数据结果进行打印。

分光光度计的使用方法主体内容：1．使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理。

以及各个操作旋钮之功能。

在未接通电源前，应该对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固。

通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源开关。

仪器在使用前先检查一下，放大器暗盒的硅胶干燥筒(在仪器的左侧)，如受潮变色，应更换干燥的蓝色硅胶或者倒出原硅胶，烘干后再用。

2．将灵敏度旋钮调置“ 1档”(放大倍率最小)。

3．开启电源，指示灯亮，选择开关置于“ T，”波长调至测试用波长。

仪器预热20 分钟。

4．打开试样室盖(光门自动关闭)，调节“ 0旋”钮，使数字显示为“ 00.0，盖上试样室盖，将比色皿架置与蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“ 100%旋”钮，使数字显示为“ 100.0。

”5．如果显示不到“ 100.0，”则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能置低倍率档使用，这样仪器将有更高的稳定性。

但改变倍率后必须按(4)重新校正“0和”“ 100%。

”6．预热后，按(4)连续几次调整“ 0和”“100%，”仪器即可进行测定工作。

7．吸光度 A 的测量按(4)调整仪器的“ 00.0和”“100%，”将选择开关置于“A，”调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000，”然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。

8．浓度 C 的测量：选择开关由“A旋”置“C，”将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值。

9．如果大幅度改变测试波长时，在调整“ 0和”“ 100%后”稍等片刻，（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“0和”“100%”即可工作。

10．每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单个调换。

11．本仪器数字表后盖，有信号输出0～1000MV，插座1脚为正，2脚为负接地线。

实验三分子荧光法测定罗丹明B的含量
一、实验原理
罗丹明B在水中是强的荧光物质，并且在低浓度时，荧光强度与罗丹明B浓度呈正比：
I f=kc
基此，测定一系列已如浓度的罗丹明B的荧光强度，然后以荧光强度对罗丹明B浓度作标准曲线，再测定未知浓度罗丹明B的荧光强度，把它代入标准曲线方程求出其浓度。

图1罗丹明B的分子结构
二、仪器与试剂
1．仪器
RF-5301PC分子荧光分光光度计；200 mL的容量瓶12支，2 mL的吸量管12支，250 mL烧杯12个。

2．试剂
l×l0-4 g∙mL-1的罗丹明B储备液。

三、实验步骤
1．标准溶液的配制
取11只200 mL的容量瓶分别加入l×l0-4 g∙mL-1的罗丹明B储备液0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20，1.40，1.60，1.80，2.00 mL,，用水稀释至刻度，摇匀。

2．绘制发射光谱
激发波长固定在556 nm, 在500-700 nm范围内扫描荧光发射光谱。

3．绘制标准曲线
荧光发射波长固定在640 nm处，从发射光谱上取系列标准溶液的荧光发射强度。

4．未知试样的测定
在标准系列溶液同样条件下，测定未知样品的荧光发射强度。

5．绘制荧光强度I f对罗丹明B溶液浓度c的标准曲线，并由标准曲线求算未知试样的浓度。

四、数据处理
1．原始数据
浓度/(l0-4 mg∙mL-1) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 x 荧光强度
扣除空白
2．标准曲线绘制和未知样品含量计算。

荧光分光光度法测定荧光素的含量一、实验目的1.学习荧光分光光度法测定荧光素的分析原理。

2.掌握荧光分光光度计的操作技术和测定荧光素的方法。

二、实验原理荧光分析法，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。

在稀溶液中，荧光强度I F 与物质的浓度c 有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。

三、仪器及试剂1．仪器RF-5301PC 荧光分光光度计；2．试剂荧光素（分析纯）；四、操作步骤1.标准溶液配制准确称取0.0125g 荧光素标样，配制成500ml 溶液，则此溶液浓度为0.025g/L.移取此溶液10.0ml ，于50ml 容量瓶中用蒸馏水稀释bcI I F εφ0303.2=KcI F =至刻度。

分别移取此溶液 1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，于50ml容量瓶中，并用蒸馏水稀释至刻度，摇匀后，待测定各标准溶液的荧光强度。

2.光谱的绘制(1)荧光光度计操作打开主机电源开关，预热大约30分钟。

开启氙灯。

(2)荧光素激发光谱的绘制，参数设置如下：①设定纵坐标②设定灵敏度；③设定扫描速度；④发射波长EMISSION Wavelength；⑤激发波长范围；⑥将某一浓度的荧光素标液置于试样池中；⑦扫描得到激发光谱。

(3)标准溶液及样品的测定，参数设置如下：①设定纵坐标②设定灵敏度；③设定扫描速度；④设定激发波长EXCITION Wavelength (从激发光谱曲线中)得到；⑤发射波长范围EMISSION Wavelength；⑥将1号标准溶液放入试样池中；⑦扫描得到荧光光谱。

仪器开始扫描，得到1号标准溶液的荧光强度。

R F-5301P C荧光分光光度计验证方案RF-5301PC荧光分光光度计验证方案（编号：）起草人：部门：起草日期：年月日审核人：、、（验证领导小组）部门：、、审核日期：年月日批准人：部门：批准日期：年月日**公司2012年03月验证目录01.验证项目02.概述03.验证目的04.验证条件05.验证合格标准06.验证范围07.验证人员08.验证内容与方法09.验证数据分析10.验证结论与偏差说明11.再验证12.验证时间安排13.附件1.验证项目RF-5301PC荧光分光光度计验证方案2.概述：2.1 RF-5301PC荧光分光光度计：设备编号：QC-016某些物质受到光照射而被激发之后，会发射出比照射波长稍长的光，这种光称为荧光。

对于给定物质来说，当激发光的波长和强度固定、液层的厚度固定、溶液的浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度c有如下关系：F=kc荧光分光光度计就是根据上述原理，对可发射荧光的物质进行定性、定量测量的分析仪器。

我公司的荧光分光光度计是于2010年7月购置，其生产厂为日本岛津公司，主要用于铝的检测。

2.3技术参数：型号：RF-5301PC电源电压：220V，50HZ体积：长667×宽530×高270mm工作时间：连续工作环境条件：环境温度：15～35℃相对温度：40%～80%电压波动：220V±10%无影响仪器使用的振动和电磁干扰生产厂家：日本岛津公司。

3.验证目的按照GMP的要求，需要对该仪器进行安装确认、运行确认、性能确认，以确定目前的实验室环境能否满足该仪器的正常操作和使用，仪器是否具有良好的检测性能，能否满足验证可接受标准和日常分析测试工作的需要。

4.验证条件4.1验证前必须对设备所用仪表进行校验，且在有效期内。

4.2验证试验过程中所用的标准溶液、空白溶液在使用前必须符合规定。

4.3验证试验所用的清洁器具和玻璃容器应按SOP程序清洁并符合要求。

RF-5301PC荧光分光光度计操作规程一.开机1.先打开RF-5301PC的电源开关（白色），再开电脑，并在D盘建立自己的文件夹。

2.运行桌面上的程序进入操作界面。

3.点击¡Configure¡ 选择[PC Configuration]设定存盘路径。

4.点击¡Configure¡ 选择[Instrument]→[Initialization]进行仪器初始化。

待初始化完成后点击OK。

二．光谱分析（Spectrum）1.点击¡Acquire Mode¡选择[Spectrum]。

2.点击¡Configure¡ 选择[Parameters] 编辑所需的测试条件。

编辑完毕后点击<OK>。

3.放入样品后，点击<START>开始扫描测试。

4.扫描结束后系统自动跳出对话框，输入文件名后点击<Save>，则文件暂时保存到内存中。

5.点击¡File¡选择[Save]将测试数据保存到自己的子目录下。

6.点击¡File¡选择[Data Translation] →[ASCII Export]进行数据转换。

三．定量分析（Quantitative）1.点击¡Acquire Mode¡选择[Quantitative]编辑所需的测试条件。

编辑完毕后点击<OK>。

2.放入空白样品后点击<Auto Zero>扣除背景。

3.放入第一个标准样，点击<Standard>后再点击<Read>，此时跳出对话框，输入标准样的浓度后点击<OK>。

4.重复操作3至测完所有标准样。

5.点击<Unknown>，然后放入未知样品，点击<Read>。

6.点击¡File¡选择[Save]将测试数据保存到自己的子目录下。