第五章 凝胶过滤层析(高等教学)

目前使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与 甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范 围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。
原理
● 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。 ● 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙， 随着溶剂流动，首先流出层析柱； ● 相对分子质量较小的物质可自由地进出 凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率 慢而最后流出层析柱。 ● 中等大小的分子在大分子物质与小分子 物质之间被洗脱。 ● 这样，经过层析柱，混合物中的各物质 按其分子大小不同而被分离。
3、样品的加入 吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上， 不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。 打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩 展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱： 加0.1mol/l的Nacl溶液洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一 管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。

特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关
Kd=0
大分子量 小分子量
Hale Waihona Puke 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、 多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、 去热源和脱色。

C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响

凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备

样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s

选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义

凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）

2.点击“方法”， 打开界面，点击界 面左下方选项，分 析输入参数。
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点击“方法”，再 点击下方的“采样 控制”，将采样结 束时间改为180分 钟，点击“采用”。
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记录图谱 保存路径
点击“电压范 围”及“时间 范围”调整电 压值范围1~10 和时间值范围 0~10。（放大 查看）
下端柱头结构
密封圈调节螺帽 的作用： 旋松时密封圈 直径缩小，便于 取出；旋紧时密 封圈被压扁，直 径变大，防止柱 体漏液。
滤膜 密封圈 垫圈
密封圈调 节螺帽
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二 . 层析柱的安装
洗净层析柱，垂直固定在柱架上:
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层析柱的安装
旋松密封圈调节螺丝 取下柱头。检查滤膜 是否存在，将柱头装 进玻璃柱体内。
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操 作 步 骤
将数据采集器通道1 （或通道2）的导线 按颜色分别接在紫 外检测仪背面“记 录仪”的接口上， 要接牢固。
打开电脑，双 击桌面的“N 2000 在线生化 工作站”，选 择通道，进入 工作站界面。
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3.点击“数据采 集”，进入层析 图谱界面
1.点击“实验信 息”，输入相关 的信息
四. 检测仪器的准备

打开紫外检测仪，预热。按照“N 2000 生化工作 站使用方法”及“核酸蛋白检测仪使用方法”连 接导线、设置参数，调整好仪器。点击“基线查 看”观察基线。
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样品的准备：
用20ml 0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液溶 解CHOM沉淀。若溶解后的溶液混浊，要 用滤纸滤去不溶物。收集滤液上 Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐。
紧上 密紧 封柱 圈头 调螺 节帽 螺后 丝记 。住 旋
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三. 装 柱

（3）聚丙烯酰胺凝胶




商品名Bio－gel 与甲叉双丙稀酰胺交联，过硫酸铵为催化剂， TEMED加速剂。改变交联剂的浓度，可以改变 孔隙，交联剂越多，孔隙越小； 常用型号 P-2和P－300，数字×103为分离的 分子量极限 聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本 近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4×105 性质 耐酸，pH1－10稳定，耐受变性剂（尿素、胍 盐等）
根据经验，组别分离时，大多采用230cm长的层析柱，分级分离时，一般需 要100cm左右长的层析柱，其直径在15cm范围内。
2）装柱 干装法 容易产生气泡 湿装法 先将适量溶剂加到柱中，将浸泡 好的凝胶缓慢倒入，一直浸泡在溶剂中， 沉降至柱高1/4－1/3时打开下端出口， 溶剂流出。
3）鉴定柱的质量 用带色的物质或蛋白质过柱均匀下降即可。 细胞色素c、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶 液过柱。
几种凝胶的比较
种类（商品名） 商品型号 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 琼脂糖凝胶 （Sepharose） G15， G25， G100… 2B, 4B, 6B… 型号中数字意义 每g的吸水量(ml)×10 数字越大，筛孔越大 颗粒中琼脂糖的含量 （％）； 数字越大，筛孔越小 排阻限度 6×105 稳定性 水、盐、碱、弱酸 中稳定；对强酸敏感


分配系数Ｋav 分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。 对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。