Takara_QuickCut限制性内切酶

《基因工程的基本工具》知识清单一、限制性内切核酸酶（限制酶）限制酶是基因工程中最重要的工具酶之一。

它就像一把精准的“分子剪刀”，能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切开。

限制酶具有特异性，不同的限制酶识别的核苷酸序列不同。

例如，EcoRⅠ限制酶识别的序列是 GAATTC，而 BamHⅠ限制酶识别的序列是 GGATCC 。

当限制酶识别到特定序列后，就会在该位点将 DNA 双链切断，形成黏性末端或平末端。

黏性末端是指被切开的 DNA 双链的末端，一条链突出几个碱基，另一条链对应位置凹进去几个碱基，就像“锯齿”一样。

而平末端则是指切开的双链末端是平齐的。

限制酶的发现和应用，为基因工程中对 DNA 进行精确的切割和操作奠定了基础。

二、DNA 连接酶有了“剪刀”将 DNA 切开，还需要“胶水”将它们连接起来，这就是DNA 连接酶的作用。

DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。

DNA 连接酶连接的是 DNA 片段之间的磷酸二酯键。

在基因工程中，常用的 DNA 连接酶有 E·coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。

E·coli DNA 连接酶只能连接黏性末端，而 T4 DNA 连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端，但连接平末端的效率相对较低。

三、载体在基因工程中，要将目的基因导入受体细胞，就需要一个“运输工具”，这就是载体。

载体需要具备一些特定的条件：1、能够在受体细胞中稳定保存并自我复制。

这样才能保证目的基因在受体细胞中能够长期存在和表达。

2、具有多个限制酶切点，以便插入目的基因。

3、具有标记基因，便于筛选含有目的基因的受体细胞。

常见的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。

质粒是一种小型的环状DNA 分子，广泛存在于细菌等原核生物中。

它具有自主复制能力，并且通常含有一些抗生素抗性基因作为标记基因。

现代分子生物学实验手册工具酶基因工程：在人工可以控制条件下，将基因剪切或重新组合，再导入另一生物体内，使这些基因在其中表达并遗传下去的一门技术。

核心：对基因进行人工切割、连接和重新组合，构建重组DNA。

工具酶：在基因工程的重组DNA过程中，所需要用到的酶的统称。

一、限制性内切酶（restriction endonuclease）主要功能：对外源性的双链DNA进行切割、水解，不允许外源性DNA存在于细菌自身细胞内。

（这种酶能对在自身细胞内存在的DNA种类给予限制——限制性内切酶）限制-修饰系统：合成限制性内切酶的细胞，其自身的DNA不受酶的切割，这是因为细菌细胞还会合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解。

保护自身遗传物质稳定的机制。

限制性内切酶：从原核生物中发现的，约600种，可识别108种不同的特定DNA顺序。

以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生DNA片段的5’端为P，3’端为- OH。

命名：获得该酶的细菌属名的第一个字母（大写）+该菌种名的前两个字母(小写)+株系的字母（小写）或数字+罗马数字（同一株菌种不同内切酶的编号）例：细菌属名细菌种名菌株名称限制酶名称Arthrobacter luteus Alu IEscherichia coli RY13Eco R IBacillus amyloliquefaciens H Ham H I Haemophilus influenzae Rd Hin d III（一）三种常用内切酶1. I型限制性内切酶同时兼有切割DNA的功能和修饰酶的修饰功能。

在酶的识别位点上，若DNA两条链菌没有发生甲基化，则行使内切酶的功能，对DNA进行切割，同时转变成ATP酶。

若DNA双链中有一条链已发生甲基化，则此类酶显示修饰酶的作用，对另一条DNA进行甲基化修饰，然后在行切割功能。

限制性内切酶限制性内切酶（又称限制酶）首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。

通常，限制性内切酶会切割双链DNA，每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，根据不同的内切酶类型，可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，识别序列长度通常为4-8bp，酶切之后会形成粘性末端和平末端。

上世纪50年代初期，许多研究团队观测到了噬菌体对于同一物种的不同细菌宿主菌株存在感染效率差异[1,2]，即：使用在一种细菌菌株（例如，大肠杆菌C）内繁殖的噬菌体λ感染同一种类的灵异菌株（例如大肠杆菌K），结果发现，相比于重新感染宿主菌株（大肠杆菌C），大肠杆菌K的感染率出现明显下降。

新的宿主（大肠杆菌K）似乎可以选择性抵御或“耐受”侵入的噬菌体。

研究人员还发现，这一现象并没有遗传性，因为经过一轮感染后，在新菌株中生长的噬菌体还可以以正常的感染率感染该菌株。

这种现象被称为“宿主控制变异”，有关其背后的机制也成为了频繁研究的领域[3]。

直到上世纪60年代，人们才发现宿主变异的机制，其与噬菌体DNA的酶切有关，进而发现并分理出了限制性内切酶。

上世纪60年代初Werner Arber观测发现，宿主范围内的决定性遗传物质都存在于噬菌体DNA中，而后续实验证明甲硫氨酸参与宿主的自我保护[4]。

这些发现最终催生了限制性修饰（R-M）体系的概念，通过该体系，来自于宿主的限制性内切酶和甲基化酶共同作用，切割外来病毒（非甲基化）DNA，同时保护宿主的DNA不受甲基化[5]。

随着DNA连接酶的发现以及位点特异性限制性内切酶的家族不断壮大，重组DNA 技术应运而生。

限制性内切酶的命名规则，考虑到内切酶来源的三种特性——属名、种名和菌株或血清型——组成了一个简短的名称，后面加上罗马数字，代表来自同一菌株的多个限制性内切酶[6]。

例如，以HindⅢ酶为代表：“H”代表Haemophilus“in”代表influenzae“d”代表血清型d“Ⅲ”用于区分来自于Haemophilusinfluenza血清型d的其它限制性内切酶限制性内切酶的分类，根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四类：TypeⅠ：同时具有限制性和甲基化活性的多亚基蛋白需要ATP切割位点与识别位点间的间距不定TypeⅡ：特异性的识别序列切割位点位于识别序列内或邻近识别序列在切割位点生成5＇磷酸基和3＇羟基末端需要M2+TypeⅢ：由两个相反的识别序列组成切割位点与其中一个识别序列的间距恒定需要ATPTypeⅣ：仅切割甲基化的DNA切割位点大约距离识别位点30bp由于自身特殊的特点，TypeⅡ限制性内切酶已经成为分子克隆、法医学DNA分析等许多研究应用最常用的限制性内切酶。

限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。

因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。

二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。

被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。

例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。

另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。

2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。

即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。

Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。

并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。

限制性核酸内切酶相关知识归纳限制性核酸内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对其相关的知识进行归纳，才有利于解答试题。

1 限制性核酸内切酶的基本知识①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。

化学本质为蛋白质。

②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。

③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。

④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。

如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。

2 限制性核酸内切酶的难点解析2.1 目的基因切割要点归纳①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。

②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。

③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。

2.2 质粒切割要点归纳①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。

如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。

切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。

②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。

③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。

2.3 限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。

如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。

一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。

不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。

DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。

NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。

NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。

应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。

不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？参考见解：1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。

请教该怎么办？参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。

说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。