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常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindII I、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioerHits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。
常用的内切酶比如Bam HI、EcoRI、HindII I、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restri ction system s typica lly contai n indivi dualrestri ction enzyme s and modifi catio n enzyme s encode d by separa te genes. The Type II restri ction enzyme s typica lly recogn ize specif ic DNA sequen ces and cleave at consta nt positi ons at or closeto that sequen ce to produc e 5-phosph atesand 3-hydrox yls. Usuall y they requir e Mg 2+ ions as a cofact or, althou gh some have more exotic requir ement s. The methyl trans feras es usuall y recogn ize the same sequen ce althou gh some are more promis cuous. Threetypesof DNA methyl trans feras es have been foundas part of Type II R-M system s formin g either C5-methyl cytos ine, N4-methyl cytos ine or N6-methyl adeni ne.酶类型识别序列ApaIType II restri ctionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restri ctionenzyme5' G^GATCC3'BglIIType II restri ctionenzyme5' A^GATCT3'EcoRIType II restri ctionenzyme5' G^AATTC3'HindII IType II restri ctionenzyme5' A^AGCTT3'KpnIType II restri ctionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restri ctionenzyme5' C^CATGG3' NdeIType II restri ctionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restri ctionenzyme5' G^CTAGC3'NotIType II restri ctionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restri ctionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restri ctionenzyme5' G^TCGAC3' SphIType II restri ctionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restri ctionenzyme5' T^CTAGA3'XhoIType II restri ctionenzyme5' C^TCGAG3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premie r5.0或Bioe dit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBA SE数据库去查（网址：http://rebas/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PC R引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buf fer的选择（MBI、罗氏、NEB、Prom eg a、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要D NA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：依照限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，别离是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；还有认知(recognize)DNA 上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，有效性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性结尾”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处置不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性结尾, 能够彼此“粘合”,再经连接酶处置, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶要紧应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必需通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮忙才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用一样的限制酶处置, 使载体带上各类各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再挑选出所需的菌株, 便取得带有某一目的基因的繁衍系.用这种方式, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必需有较高的复制率, 以求取得大量的基因产物；必需具有一个选择性标志, 以便挑选；还要有一最多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求利用平安。
限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。
因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。
二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。
被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。
例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。
另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。
2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。
即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。
Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。
并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。
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常用限制性内切酶和DNA聚合酶外文字符的规范编排一、限制性内切酶限制酶的命名，1973年由Smith和Nathans提出：用属名的头1个字母和种名的头2个字母，组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称；如有菌株名，再加上一个字母，即第4个字母表示菌株；1种特殊的菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。
例如：Eco R I, 第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母；第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母；第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。
再如，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。
例如，从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzad d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为Hin d I、Hin d Ⅱ和Hin d Ⅲ。
限制性内切酶符号前3个字母为其来源菌株的拉丁名缩写形式，根据现有的外文字符使用规范，“生物学中属以下（含属）的拉丁文学名要用斜体字母”表示，所以，前3个字母用斜体形式编排。
第4个字母表示菌株，一般表示菌株的字母都用正体形式。
二、耐热DNA聚合酶DNA聚合酶是PCR反应的重要工具。
同限制性内切酶命名方法类似，耐热DNA聚合酶也与其来源菌名称有关。
例如：Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶等，前3个字母都是表示来源于生物的，第1个字母是其来源生物的属名的首字母，第2、3个字母是其种名前的2个字母。
因此，这3个字母都应该用斜体，并且首字母要用大写；因为Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌（Thermus aquaticus）yT1株分离提取的，Pfu DNA聚合酶是来自耐热菌Pyrococcus furiosus的一种DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶是来自嗜热细菌Thermus thermophilus的一种DNA聚合酶。
常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。
先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。
常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。
下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。
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