人类外周血染色体标本制备以及G带标本制备

人体外周血染色体G显带制备的影响因素【摘要】染色体G显带技术是研究染色体数目和结构畸变的基础，整个制片过程繁琐，接种、收获、制片、显带等因素都可影响染色体标本的最终效果。

【Abstract】Chromosome G banding technique is the study of chromosome number and structural abnormalities of the base, The entire production procedure,includinginoculation, harvesting, production, banding and other factors can affect the chromosome specimen of the final results.【Key words】Chromosome G banding；Factors；Remedial measures1染色体G显带玻片的制作1.1取血与接种时间一次性真空采血肝素抗凝管(3 ml规格)，常规消毒肘部皮肤及抗凝管的进针处，抽取静脉血2～3 ml，轻轻摇匀，防止凝固，待接种培养。

当天不能培养的标本应及时置于4℃冰箱存放以免影响细胞的活力，一般在采血后1～3 d内可进行培养。

在4℃冰箱保存6 d的标本我们也曾培养，且染色体质量也不错。

由于存放时间长，有活性的淋巴细胞少，此时应1000 r/min离心10 min后取白细胞层接种。

1.2细胞培养基与接种全血量人体血液中的淋巴细胞是一种分化细胞,它的细胞质很少,RNA 和蛋白质的6合成速度也很慢，淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。

当在培养基中加入植物血凝素(phytohemagglutininPHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂，进入淋巴细胞生长周期。

细胞经过68～76 h的培养，处于分裂期的细胞可达20%以上(我们曾做过此类的实验)，此时加入秋水仙素便可获得大量的中期分裂相细胞。

实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。

掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。

3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。

初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。

二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。

人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。

染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。

通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。

在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。

G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。

染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。

人外周血染色体标本制备一、培养基的选择与接种培养基主要的作用是为培养的细胞提供营养，以让其更好的生长。

其基本成分有双抗（青霉素和链霉素）、水、PHA、小牛血清、酚红等。

小牛血清和植物血凝素偏高或偏低，以及PH值均会影响染色体的分裂。

反复冻融的培养基对培养的效果也不好，一因PHA随着不断的解冻其效价也不断降低，二是因为含有细胞DNA生长必须的氨基酸，而此氨基酸会随不断的解冻而消失。

培养基颜色改变及浑浊均不能再用。

接种血液时，视不同年龄群的人而异。

小孩或者新生儿接种量比成人少，因为小孩和新生儿的白细胞比成人的高很多。

血液太少，细胞稀薄并且生长速度减慢；血液太多，会造成培养细胞生长时营养成分不够，影响细胞的生长状态。

二、秋水仙素其作用是阻断纺锤体拉向两级，使正在分裂的细胞停留在分裂中期，以便获得大量中期的分裂相以分析染色体之用。

使用秋水仙素时应注意使用时间、作用时间、浓度、量等。

一般而言，在收获细胞前1.5-2h加入。

加入过多，染色体太短；反之，染色体瘦长或无中期分裂相。

三、低渗这是染色体制备中关键的环节，目的是使淋巴细胞吸收水分而膨胀和中期染色体分散铺展。

低渗效果与处理的时间、低渗的温度，低渗时吹打混匀细胞的力度有关。

一般用0.075mol/L的KCL。

低渗时间不够，染色体分散不好，细胞粘连，呈团状；低渗时间过长，可是细胞破碎，染色体丢失，甚至会因染色体胀大得过分和使其形态结构模糊不清，变得难以消化及染色。

一般加入8毫升，于37度水浴箱中低渗20-30min为好。

四、固定为了维持染色体的固有形态。

固定液可使细胞脱水，蛋白变性而使染色体粗大适中。

注意：固定液需要现配现用，因为固定液所含的水分与固定效果有关。

吹打细胞时，要注意用力，以免细胞丢失过多，因为低渗后的细胞很脆弱。

五、滴片先制成细胞悬液，浓度适中，随个人喜好。

但不因太浓，因其会使染色体分散程度受限。

也不宜太淡，以免滴片时细胞分裂相稀少。

一定要注意好温度、湿度的关系，这是要点。

实验一人类体细胞染色体标本制备与核型分析Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype【实验目的】1．熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。

2．熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。

【实验原理】染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。

因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。

正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。

因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。

上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。

【实验用品】1．采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。

2．RPMI 1640液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa 原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。

3．2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。

【实验步骤】精品文档一．外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析1. 采血及接种培养1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。

1.2 常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。

人类染色体G显带标本的制备一、原理常规制备的染色体标本经烤片后，用热碱、各种蛋白酶、尿素、去垢剂或其它溶液等预处理再以Giemsa 染色，在油镜下可看到染色体两臂显示出着色深浅不同的横纹。

最常用的是胰蛋白酶法。

可能的机理是：G带区含有较丰富的A-T 对，在间期核呈固缩状态，而且是DNA晚复制区之一。

Giemsa染料在G带区是与DNA结合，而且与结合DNA的染色质非组蛋白有关。

Giemsa染料是噻嗪--曙红染料，染色体的着色有赖于在原位形成噻嗪--曙红（2∶1）的沉淀物。

着色首先取决于二个噻嗪分子同DNA结合，在此基础上再结合一个曙红分子，其次取决于一个疏水环境，以利于染料沉淀而着色。

通过胰酶的显带预处理可除去阴性G带区的疏水蛋白，或使它们的结构变成更亲水状态。

由此可知，在G显带中抽取的蛋白往往是疏水的，且主要来自阴性G带区。

二、试剂及器材（一）试剂：胰蛋白酶、0.4%酚红、5% NaHCO3、Giemsa原液、pH7.4磷酸盐缓冲液，0.85%生理盐水（二）器材：37℃恒温水浴箱、染色缸、刻度吸管、滴头三、实验步骤1、取胰酶25mg，溶解于盛有50 ml0.85%生理盐水的染色缸中，置37℃恒温水浴箱中，加入0.4%酚红2滴，混匀，以5% NaHCO3调节pH为6.6-7.0。

2、待胰酶液温度升至37℃后，将染色体标本片（37℃烘箱烤片3-7天）放入胰酶液中，并轻轻摆动，3-7秒后取出，立即自来水冲洗。

3、染色：pH7.4磷酸盐缓冲液 4.5 mlGiemsa原液0.5 ml染色8-10分钟。

自来水冲洗，空气干燥，镜检。

四、注意事项1、良好的培养效果为，标本片上中期分裂相要多，且染色体分散要好。

2、染色体长度应能适应显带分析技术的要求。

3、G显带成败之关键取决于胰酶液的浓度和处理时间之搭配。

五、实验结果低倍镜下可看到中期分裂相，进而转至高倍镜及油镜下观察，可见23对染色体较为饱满，分布均匀，着色较好，沿染色体长轴可显出深浅不同的G带横纹。

外周血染色体制备及分析原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。

外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。

由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：一、试剂准备1、0.2%的肝素溶液2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存）3、0.075mol/Ll氯化钾溶液4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。

置37℃培养箱内培养72小时。

每日早晚定时摇匀培养物1次。

收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。

摇匀后继续培养 2小时。

三、收获细胞培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。

1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。

2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。