外周血染色体标本制作
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人类外周血染色体标本制备及G带观察及核型分析
实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩： 实验名称： 人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析 同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果二、操作步骤 四、讨论分析一、 实验目的及原理熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。
初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。
通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。
在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。
在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。
但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。
在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。
再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。
最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。
本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa 染色。
胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。
通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。
由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。
关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。
二、操作步骤人类外周血染色体标本制备１、采血２、培养RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。
3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。
外周血淋巴细胞染色体制备与分析技术规范
外周血染色体制备与分析技术规范原理：在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。
植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。
具有用血量少、操作简单等优点。
1、实验材料2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。
2、培养液配制无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：RPMI 1640或199 90%小牛血清 10%PHA（自制） 0.1ml 3%肝素 10u/ml 2%双抗 100u/ml（选择）分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。
3、植物油凝素的制备植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。
自制的方法常用生理盐水提取法。
（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。
恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。
每8-12小时摇荡一次。
（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。
在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。
注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。
染色体标本制备
• 4、制片： （1）离心：从温箱中取出培养瓶，用毛细吸管将培 养液转入5ml的刻度离心管内。1200rpm，离心 8min。 （2）低渗：弃去上清液。加入37℃预热（中午开 水浴箱）的0.075mol/L KCl低渗液，加至5ml，用 毛细吸管轻轻吹打均匀，放在37℃恒温水浴中 20min。 （3）预固定：在离心管中加入现配的（实验前配制） 甲醇-冰醋酸(3:1)固定液约0.5ml，用毛细吸管吹 打轻轻混匀, 室温固定20min。 （4）再次离心：1200rpm离心8min。
实验步骤
• 1、采血：将皮肤常规消毒后静脉采血约2-3ml 。 • 2、种血及培养：将7号针头缓慢加15滴（约0.3 ml 血样）立即接种含到5ml培养液（含PHA ）的培养 瓶内，轻轻摇匀后将培养瓶放在37℃温箱中培养 72h。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。 • 3、秋水仙素处理：在终止培养前4h加秋水仙素处 理（星期五上午11：30加），向各培养瓶中加2滴 秋水仙素（终浓度20µg/ml），轻轻摇匀后继续培 养。
外周血染色 • • • 血样：每班6个同学采集外周血 试剂： 1640培养液含植物血凝素(PHA)， 20µg/ml秋水仙素液， 0.075 mol/L KCl溶液 固定液：甲醇-冰醋酸(3:1) （实验前配制） Giemsa液
实验仪器及用具
• 恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱 、冰箱 • 注射器以及消毒酒精 • 培养瓶120个、吸管120支、离心管 (5ml)120支、 • 冰载玻片： 饭盒加纯净水，加冰，4度冰箱， 120张。
（5）第一次固定：弃上清液，加入固定液约5ml， 立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定 20min。1 200rpm离心8min。 （6）第二次固定：同第一次固定。 （7）弃上清液，根据沉淀量的多少，加入适量固定 液1～2滴，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。 （8）滴片：在30-40cm高处将细胞悬液滴在预冷的 载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。马 上吹散，酒精灯烘烤（烘干50－60％程度），滴 －吹－烤。 样本编号后学生本次实验结束。老师课后染色。
外周血染色体标本制作
染色体制备技术
01
02
03
低渗处理
通过低渗处理使细胞膨胀， 促使细胞膜变软，以便于 染色体的分离和制备。
固定剂使用
使用固定剂如甲醇和冰醋 酸对细胞进行固定，以保 持染色体的形态和稳定性。
细胞离心与洗涤
通过离心将细胞与培养基 分离，并使用洗涤液去除 杂质，得到纯净的染色体 标本。
染色与计数方法
染色体染色
采用吉姆萨染色或瑞氏染 色等方法对染色体进行染 色，以便于观察和计数。
计数规则
遵循特定的染色体计数规 则，如根据染色体的形态、 大小、着丝粒位置等进行 计数。
图像分析系统
采用图像分析系统对染色 体进行数字化分析，提高 计数准确性和效率。
质量控制与标准化
操作规范
制定严格的操作规范，确保染色体标本制作的每 一步都符合标准要求。
诊断信息。
失败案例分析
案例一
某医院在制作外周血染色体标本时，由于采血量不足，导致制片过程中出现了染色体断裂、重叠等现 象，最终无法提供准确的诊断结果。
案例二
某实验室在制作外周血染色体标本时，由于抗凝剂配比不当，导致制片过程中出现了染色体凝集、溶 解等现象，同样无法提供准确的诊断结果。
经验教训与改进建议
• 经验教训：成功和失败的案例都表明， 制作外周血染色体标本需要严格遵守 操作规程，注重细节处理，如采血量 的控制、抗凝剂的配比等。同时，要 不断提高技术水平，加强质量监控， 确保制片效果符合临床诊断的要求。
经验教训与改进建议
01
改进建议
02
加强技术培训和交流，提高操作人员的技能水平；
03
建立完善的质量监控体系，对每个环节进行严格把关；
03 关键技术及注意事项
外周血染色体标本的制备法
附件一外周血染色体标本的制备法该法是制备各种染色体标本的基础。
一、操作过程：1、采血：先在采血者肘部用碘酒棉球及酒精棉球消毒皮肤，再取2毫升干燥灭菌注射器，配上针头（6～7号），并吸取0.2%的肝素液（Heparin）0.2毫升，湿润针筒。
再从肘部静脉采血0.7～1毫升，轻轻转动针筒，使之与肝素混匀。
2、培养：拔去抽血用针头，立即插入灭菌试管内，送入无菌操作箱（此时操作者必须用肥皂洗刷双手，并用自来水冲洗干净，然后双手进入无菌操作箱，依次用碘酒及酒精棉球消毒双手，在火焰旁将血液平均滴入2～3个已盛好培养基的小瓶内（培养基的组合：RPMI 1640或Eagle或M 199毫升，小牛血清1毫升，PHA 5毫克，用5%NaHCO3调pH至7.0～7.4），盖上翻口瓶盖，轻轻摇动。
如到外地采血培养亦可因地制宜，无需在无菌操作箱内接种，方法是：抽血完毕，转动针筒，将血液与肝素混匀，拔去针头，重新换上灭菌注射针头，将血液直接从翻口橡皮塞（用碘酒及酒精棉班干部消毒）上插入，将血液缓缓滴入培养瓶内，轻轻摇动，置370C温箱中培养66～72小时。
秋水仙素（Colchieine）处理：在终止培养前4～6小时，将事先配制好的0.01%秋水仙素1滴（每毫升50滴约2μg）加入培养瓶内，轻轻摇动，放回温箱中，继续培养4～6小时，这样使细胞分裂停止在中期。
4、离心：用吸管吸取培养物，并移入刻度离心管内，以1000转/分离心8分钟，吸去上清液，留底层离心沉淀物。
5、低渗处理：加5毫升预温（370C）的0.75M KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，仍放回370C温箱中，静止15分钟。
这样使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。
6、预固定：在低渗15分钟后，加固定剂（冰醋酸:甲醇，1:3）1毫升，打匀。
7、再离心：为了收集细胞，以1000转/分离心8分钟，然后吸去上层液，保留沉淀物。
8、固定：沿离心管管壁加入新配制固定液（甲醇:冰醋酸，3:1）5毫升，过5分钟后，用吸管将底部沉淀物轻轻打匀，继续固定30分钟。
人外周血染色体标本制备
人外周血染色体标本制备一、培养基的选择与接种培养基主要的作用是为培养的细胞提供营养，以让其更好的生长。
其基本成分有双抗（青霉素和链霉素）、水、PHA、小牛血清、酚红等。
小牛血清和植物血凝素偏高或偏低，以及PH值均会影响染色体的分裂。
反复冻融的培养基对培养的效果也不好，一因PHA随着不断的解冻其效价也不断降低，二是因为含有细胞DNA生长必须的氨基酸，而此氨基酸会随不断的解冻而消失。
培养基颜色改变及浑浊均不能再用。
接种血液时，视不同年龄群的人而异。
小孩或者新生儿接种量比成人少，因为小孩和新生儿的白细胞比成人的高很多。
血液太少，细胞稀薄并且生长速度减慢；血液太多，会造成培养细胞生长时营养成分不够，影响细胞的生长状态。
二、秋水仙素其作用是阻断纺锤体拉向两级，使正在分裂的细胞停留在分裂中期，以便获得大量中期的分裂相以分析染色体之用。
使用秋水仙素时应注意使用时间、作用时间、浓度、量等。
一般而言，在收获细胞前1.5-2h加入。
加入过多，染色体太短；反之，染色体瘦长或无中期分裂相。
三、低渗这是染色体制备中关键的环节，目的是使淋巴细胞吸收水分而膨胀和中期染色体分散铺展。
低渗效果与处理的时间、低渗的温度，低渗时吹打混匀细胞的力度有关。
一般用0.075mol/L的KCL。
低渗时间不够，染色体分散不好，细胞粘连，呈团状；低渗时间过长，可是细胞破碎，染色体丢失，甚至会因染色体胀大得过分和使其形态结构模糊不清，变得难以消化及染色。
一般加入8毫升，于37度水浴箱中低渗20-30min为好。
四、固定为了维持染色体的固有形态。
固定液可使细胞脱水，蛋白变性而使染色体粗大适中。
注意：固定液需要现配现用，因为固定液所含的水分与固定效果有关。
吹打细胞时，要注意用力，以免细胞丢失过多，因为低渗后的细胞很脆弱。
五、滴片先制成细胞悬液，浓度适中，随个人喜好。
但不因太浓，因其会使染色体分散程度受限。
也不宜太淡，以免滴片时细胞分裂相稀少。
一定要注意好温度、湿度的关系，这是要点。
外周血细胞培养法制备染色体
外周血细胞培养法制备染色体外周血细胞培养法制备鱼染色体一体外培养1．培养基的配制：在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：RPMI-1640 84ml小牛血清15mlPHA 2支0.1%肝素钠1ml双抗终浓度为100单位/ml（可不加）以5% NaHCO3（无菌）或1N HCl调pH至7.2－7.4。
2．采血：用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，实验鱼尾部用碘酒消毒后，从尾静脉取血。
3．培养：将抗凝血加入培养液中，每10ml培养液中约加入0.2ml抗凝血。
24℃，5%二氧化碳浓度的培养箱中培养，时间为68-72小时。
培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。
4．秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中用1ml注射器滴加入10ug/ml 的秋水仙碱，使终浓度为0.05-0.07μg/ml。
以上步骤均需无菌操作。
二染色体制备1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心5分钟，弃上清液。
2．低渗处理：向刻度离心管中加入低渗液9ml，用滴管混匀，低渗25-30分钟。
3．预固定：低渗后加入1ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心5分钟。
4．固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。
1000rpm离心5分钟，弃上清液。
5．重复步骤4两次6．制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
7．滴片：吸取细胞悬液自20—30cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，空气中自然干燥。
8．染色：1:10 Giemsa染液染色20-40分钟，细水冲洗背面去多余染液，气干。
9．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
三注意事项l．培养温度应稳定，培养液pH一般为为7.2—7.4。
2．秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。
都不宜观察形态及计数。
故秋水仙素的浓度及时间需要根据实际情况摸索。
3．低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。
人类外周血染色体标本制备以及G带标本制备
实验报告课程名称：分子医学实验指导老师：_ _ ________成绩：__________________实验名称：人类外周血染色体标本制备以及G带标本制备组别：___同组学生姓名：一、实验原理1.人类外周血染色体标本制备在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。
在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。
但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。
在细胞培养过程中加入植物血凝素（phytohaemagglutinin, PHA），可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。
再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。
最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。
本方法在遗传病的诊断等方面广泛应用。
2.G带标本标本制备将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行预处理，胰酶可以从染色体上抽取特定的疏水蛋白然后用Giemsa染色。
A-T相对丰富的区域染为深带，G-C相对丰富的区域染为浅带Giemsa染料是由天青和伊红分子，染色首先取决于二个天青分子同DNA结合，在此基础上它们结合一个伊红分子，其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。
二、实验步骤1. 采血、接种2. 细胞培养（lymphocytes culture）RPMI1640培养液(含PHA)，37℃±0.5℃恒温中培养72小时。
3. 秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。
4. 离心（centrifugation）以1000rpm离心10分钟，弃上清，留沉淀，并用吸管打匀。
人类外周血染色体标本制备
整体实验安排：课堂教学主要进行五个独立的实验，包括：人类外周血染色体标本制备；人类染色体Ｇ带标本制备及观察；遗传病基因突变分析（SSCP）；进行性肌营养不良症（DMD）基因检测；人类染色体核型分析实验一1. 人类外周血染色体标本制备1）实验目的：通过实验初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。
2）实验原理：正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。
1960年，Nowell和Morhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)和其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。
这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。
外周血是除骨髓之外的血液，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血外周血液中，再在从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞成为外周血干细胞正常人外周血中一般看不见幼稚的干细胞的,只存在有极少量的造血干细胞，其含量为0.01%左右。
如果幼稚细胞的比例大幅增加，有可能是类白血病。
正因为存在0.01%的造血干细胞，可利用细胞分离的技术(血细胞自动分离机)，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者以之代替骨髓而进行的干细胞移植，称为外周血干细胞移植。
外周血培养基配制一、配制用水培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。
按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。
二、培养基培养基有天然、人工两种。
一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。
NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［目的与要求］ 1、掌握外周细胞培养物收获方法; 2、掌握外周血细胞染色体标本制备； 3、熟悉相关试剂的配制。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［原理］经低渗处理，细胞膨胀，然后用 固定液使细胞膜蛋白变性，保持细胞处于 膨胀状态；调节上述收获细胞的浓ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，制 成细胞悬液，滴片，即可得到有丝分裂中 期的染色体标本。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［收获］ 1、离心
将培养物转入刻度离心管内，以1500r/min 离心10min，弃上清液，留下沉淀物。
2、低渗 在离心管中加入预温至37℃的低渗液
（0.075 mol/L KCl）8ml，用吸管轻轻吹打混 匀细胞，置入37℃水浴箱中低渗30min。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［收获］ 3、预固定
低渗处理后，在离心管中加入固定液[甲醇 : 冰 乙酸=3:1，新配备]2ml或至10ml刻度，混匀。以 1500r/min离心10min，弃上清液，留下约0.5ml液体 盖着沉淀物，轻柔重悬细胞。
4、第1次固定 预固定后，往离心管加入新鲜因定液至10ml刻度，
充分混匀细胞，在室温中固定30min。以1500r/min离 心10min，弃上清液，留下沉淀。
［培养］ 培养72h，并每天将培养瓶振荡1~2次，在终止
培养前2h~4h，在培养物中加入秋水仙素（10mg/L） 0.2ml，混匀，继续培养到收获。
染色体标本制作准备--载玻片清洁
［载玻片清洁］
1、用过饱和洗衣粉溶液浸泡载玻片1h以上； 2、用自来水彻底冲洗干净载玻片上的洗衣粉成分； 3、将干净的载玻片置于长方形浅缸，蒸馏水冲洗3 次后，用蒸馏水浸泡置于冰箱冷冻待用。
人类外周血染色体标本制备和人类染色体Ｇ带标本制备及观察
实验报告课程名称：分子医学实验 指导老师： 成绩：实验名称：人类外周血染色体标本制备和人类染色体Ｇ带标本制备及观察 同组学生姓名一、实验目的和要求 二、实验内容和原理三、实验材料和主要仪器 四、实验方法和步骤五、实验数据记录和处理 六、实验结果和分析七、 实验讨论和心得一、 实验目的1.通过实验初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法2.通过实验初步掌握人类染色体G 带标本制备的方法 二、 实验内容和原理 人类外周血染色体标本制备正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中没有分裂相。
1960年，Nowell 和Moorhead 证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)和其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。
这样经过短期培养，秋水仙素的处理、低渗和固定，就可以迅速而简便的获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。
人类染色体Ｇ带标本制备将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行预处理，胰酶可以从染色体上抽取特定的疏水蛋白，然后用Giemsa 染色。
A-T 相对丰富的区域染为深带， G-C 相对丰富的区域染为浅带。
三、 实验器材和材料实验材料：人外周血。
实验器材：离心机、恒温培养箱、恒温水浴锅、培养瓶、刻度离心管、注射器和针头、吸管、量筒、酒精灯、pH计、研钵、火柴等。
实验试剂：培养液、肝素、0.075mol/L的KCl溶液、10ug/mL秋水仙素溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆沙染液、磷酸缓冲液。
四、实验内容和程序人类外周血染色体标本制备采血：供血者肘部采取静脉血2ml，与2ml肝素混匀。
培养：采血完毕后将针头插入RPMI1640培养瓶中，每瓶滴20-30滴，摇匀。
置于37℃±0.5℃恒温中培养72h，期间摇动2-3次。
离心： 1000转/分离心10分钟，弃去上清液，留底层沉淀物。
外周血染色体制备及分析
外周血染色体制备及分析原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。
外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。
由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：一、试剂准备1、0.2%的肝素溶液2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存）3、0.075mol/Ll氯化钾溶液4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。
置37℃培养箱内培养72小时。
每日早晚定时摇匀培养物1次。
收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。
摇匀后继续培养 2小时。
三、收获细胞培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。
1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。
2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。
人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备
实验方法
（5）制备细胞悬液： 预留0.2～0.3ml固定液 ，加2滴新配固定液制成细胞悬 液 （6）滴片： 吸取细胞悬液，滴2～3滴于冰镇的载玻片上,于酒精灯火 焰上过火后，空气干燥。(每组3张，只染1张） （7）染色： Giemsa染液染色10分钟，自来水轻冲洗，晾干，镜检。
五、实验结果
• 在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分 裂相，再转至油镜观察。
实验方法
2.染色体的制备
（1）收获细胞：用吸管吸取培养物，移至离心管中，以1500 转/分离心10分钟，弃去上清液，留下沉淀物约0.3ml。 （2）低渗处理：加入预温37℃的低渗液至8ml，用吸管轻吹打 混匀，置于37℃恒温水浴锅中低渗20分钟 。低渗后吹打要 轻,以防细胞破裂. （3）预固定：缓缓加入1ml新配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3: 1），立即用吸管轻吹打混匀。以1500转/分离心10分钟，弃 上清液， 留约0.3ml沉淀物。 （4）固定：加入新鲜固定液至8ml，吸管吹打混匀，室温固定 20分钟， 1500转/分离心10min，去上清液。依上胞
PHA 37℃ 68h
G0期或G1期
秋水仙素 至72 h
三、实验用品
• 1.材料：人体外周血 • 2.器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸 管、恒温水浴锅等 • 3.试剂：培养基、秋水仙素（12.5μ g∕ml）、植物凝 集素（PHA）、肝素、0.075Mkcl低渗液、甲醇、冰乙 酸、PH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。
每组上交2张未经染色染色体标本。
人类染色体标本的制作
细胞与遗传学教研室
一、实验目的 1.掌握人类染色体标本的制作方法 2.了解人类染色体形态结构特征
24hrs 时加 入 BrdU
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3 固定
• 醋酸是染色体的一种理想的固定剂，它可使染色体结构保
1 纺锤体抑制剂
• 与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优点是，在
广泛的温度范围内都是有活性的。在热带地区的夏季，那 怕气温高达43.3℃，对秋水仙素的活性也无显著影响，有 人将秋水仙素加入保存在8—9℃的组织中，发现中期细胞 的数目比保存在室温但未加秋水仙素的组织要多得多，而 且染色体的结构也很清楚。 乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生物。它的 功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作用只有秋水仙素的 1／30一1／40。4—6×10-6的浓度即可得到所希望的效 应。 除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤体抑制剂。 如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长春花碱等，它们在人 体细胞均可产生良好效果。
1 纺锤体抑制剂
秋水仙素的作用与其浓度和作用时间相关，在高浓度 时可以延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺锤体的形 成。 在秋水仙素作用下，染色单体缩短，着色变深以致 外形清晰。但不同染色体缩短的程度不一，长的染色体比 短的染色体浓缩得更明显些。从能收集到足够的中期细胞 考虑，秋水仙素处理的时间宜长些，所用的浓度宜高些； 但从能得到较为细长的染色体考虑，处理的时间宜短，所 用的浓度宜低。因而秋水仙素处理的方法应同时兼顾这二 个方面。如果处理的时间太短则标本中的分裂细胞就少； 与此相反，如果处理的时间太长分裂细胞虽多，但染色体 缩得太短，以致形态模糊，就难以获得优良的显带标本。
2低渗溶液
经过秋水仙素处理后，细胞内的染色体比较适合于 观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞的染色体数 目多，形状小，最大的染色体约7—8微米，加之主要的观 察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此 散开，并且尽可能处于同一平面上。这些均有赖于低渗处 理。
2低渗溶液
2.1基本原理和机制 1965徐道觉发现未作低渗处理时，伴随染色体的一 些零乱的物质类似于核糖核蛋白体的颗粒，显然是有丝分 裂中核仁崩溃时的残存物。而低渗处理后，这些物质就消 失了。可见，低渗处理不只是凭借反渗透作用使细胞膨胀 染色体铺展，而且还可使粘附于染色体的核仁物质散开， 这样就能看清楚每一个扭曲的染色体。现在知道，覆盖在 染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散。
1 纺锤体抑制剂
1.2主要的纺锤体抑制剂及其作用特点 • 秋水仙素 • 秋水仙素（colchicine）是一种生物碱，因最初从百合科植 物秋水仙（Colchicum autumnale）中提取出来，故名。 分子式C22H25O6N。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点 157℃。易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。 味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使 染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分 裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。在这样的有丝 分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个 子细胞，因而使染色体加倍。
2低渗溶液
2.3低渗处理过程 秋水仙素处理2-4小时后，小心地从温箱取出培养瓶， 用滴管将培养液转移到10ml离心管并置离心机内离心，转 速为1500rpm，离心10min。离心后用滴管吸弃上清液， 培养物沉积在管底。然后加入37º 温育的低渗液8毫升，用 滴管吹打成单个细胞悬液，置37º C水浴处理20-30min，使 红细胞破碎，白细胞膨胀。
3 固定
• 最后，理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，
即能增强染色体的嗜碱性。例如，甲醛虽具有优良固定剂 的其它所有特性，但却会降低染色体的嗜碱性，所以不能 单独用作染色体的固定剂。 显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件， 因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染 色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此，那怕是最佳固 定剂仍难免有不足之处。首先，细胞被杀死后发生的基本 变化很难予以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分； 最后即使操作十分谨慎，仍难以保持酶活性不变；此外， 某些化学物还会导致细胞的皱缩。
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1 纺锤体抑制剂
1.3处理过程 培养终止前在培养基中加入浓度为20μg/ml的秋水仙 素0.05~0.1ml（1ml注射器滴垂直3-5滴）使其最终浓度为 0.4~0.8μg/ml，置5%CO2、37º C±0.5º C培养箱中处理 2~4h。
1 纺锤体抑制剂
1.4注意事项 应当注意的是经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种 不同的固定液(金属固定液或非金属固定液)予以固定，但 一定要在固定之前把秋水仙素从组织或细胞上冲洗掉，否 则沉积在细胞表面的秋水仙素不仅会影响染色体的形态， 而且还会阻碍固定液的穿透性。为此，在低渗处理后，应 尽早地加快速穿透液，如甲醇—冰醋酸固定液。要不然在 固定的时候，细胞核仍可能进入代谢期。
2低渗溶液
2.4影响低渗效果的因素 影响低渗处理的效果是以下三个因素：低渗溶液的 化学组成、低渗的强度和处理的时间。处理时间太短则染 色体铺展不好，处理时间过长会引起细胞破裂甚至由于染 色体胀得太大而致形态结构模糊。因此，在实际操作中， 对某一种组织究竟应选用哪一种低制剂
细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁由13 条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋白，而微管 蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种。α微管蛋白和β微管蛋 白组成的异二聚体构成微管亚单位，若干个异二聚体相接 连成原丝。α微管蛋白与β微管蛋白在化学结构上极为相似， 两者42%序列相同。其中β微管蛋白肽链中第201位为半胱 氨酸，为秋水仙素结合部位。如果结合的部位被其结合， 微管不仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。
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3 固定
3.2固定液的种类 • 醋酸 • 作为混合固定液的一种成分，醋酸的优点在于：（1）可 以与已知的任何一种固定剂同时使用，并且可以和任意比 例的水、乙醇或甲醇混合；（2）浓度可以很低（1%）也 可以很高（99%）；（3）具有很强的穿透性能，比乙醇 的穿透性还高。 • 醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋 白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色 体收缩，使染色体的结构免于被破坏。经醋酸固定的物质 还能抵销乙醇的硬化作用。
1 纺锤体抑制剂
1.1基本原理和机制 • 使染色体散开并清楚地呈现次缢痕，凭借的原理是改变细 胞质的粘度。因为在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染 色体紧靠在一起，很难进行分析。纺锤体的形成取决于细 胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡。因此，改变细胞质 的粘度就能破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，或者 更确切地说，染色体不再粘附至细胞内的任何结合力上。 所以在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很易铺展 开来。同时，由于染色体的不同区段上水合作用的能力不 一，当细胞质的粘度发生变化时，就会使缢痕区显示得更 为清楚。
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3 固定
细胞的膨胀和染色体的皱缩是决定固定剂质量的两 个重要因素。以往曾认为渗透压是促使细胞内结构膨胀或 破坏的决定性因索，为此选用等渗液作为固定剂，其实这 种看法是不正确的。事实证明，稀释的醋酸具有20个大气 压，照常可使细胞和组织膨胀，而只有2.5个大气压的苦 味酸却可使组织大大地收缩。这提示一种固定剂的效果如 何与渗透压的关系很小。另一方面，苦味酸使蛋白质沉淀 的作用很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀 这一特性在导致染色体收缩方面可能起重要作用。因此， 在选用哪些化学物作为固定剂时，需要权衡以上这些因素。
固定是组织、细胞或其成分选择性地固定于某一特 定阶段的过程。其目的是杀死细胞但又要避免所研究的成 分受到破坏。 不同物种对固定剂的反应是不一的，哺乳类动物染 色体的固定尤其需要特定的方法，这是因为每种生物的细 胞质成分彼此各异的缘故。生物类型本身的复杂性及多细 胞生物中细胞内的变化较大，以致很难在细胞水平上分析 固定的效应。
1 纺锤体抑制剂
故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和 终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺锤体抑制剂 能引起有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺锤体的形成， 但不影响染色体的复制和着丝粒的分裂使正在分裂的细胞 停留在中期，以获得大量分裂相供分析之用。秋水仙素积 累分裂中期的作用，几乎对所有植物器官和许多动物的器 官都是十分有效的。
3 固定
3.1基本原理与机制 • 用于固定的化学物对细胞都具有杀死作用，这类化学物可 分成二大类：一类能使染色体固缩，或使核酸和蛋白质纤 丝相脱离，另一类则可维持染色体结构的完整性。 • 为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及嗜碱 性，就需要使染色质物质沉淀。在活体条件下，细胞内不 同成分之间的相差并不足以使它们成为一种明显的单位。 可是随着蛋白质的凝结和沉淀，染色体的折射系数将发生 很大的变化从而使它们在细胞内成为明显的小体。正因为 如此，迄今所用的固定剂都具有交链蛋白质的特性，都能 使染色质沉淀。尽管常用的染色体固定剂往往是数种化学 物的混合物，但其中至少有一种化学物必须具备这一特性。
3 固定
固定剂的另一重要特性是能迅速地穿透组织或细胞， 并在—瞬间内杀死它们，这样方能使正在分裂的细胞立即 阻留在各自的时相上。瞬间杀死是很重要的，否则核分裂 仍可继续下去并到达所谓的“休止相”或“代谢相”，那 就无从研究染色体了。
3 固定
可是，随着细胞的死亡而出现的另一些变化(特别是 蛋白质的自溶作用)，往往会破坏染色体的原来结构。在 正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死 亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用， 即使复合蛋白质裂解为简单的氨基酸。因为多肽是染色体 的主要成分之一，所以这种变性效应最终将引起染色体结 构的破坏。因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自 溶作用。此外，在细胞致死的同时，细菌的活动致使细胞 内成分的分解。因此一种好的固定剂应当既能起到防腐作 用，又能阻止细菌的分解作用。
外周血染色体标本制作
一、染色体标本制备原理
在细胞遗传学研究中，为了使细胞质透明，离解胞 间层，使组织软化，且使染色体彼此铺展开而又能清楚地 显示缢痕，往往需要对正在分裂或已经收获的细胞作一系 列预处理。有时，在对细胞进行固定的时候，为了使固定 剂迅速渗透到组织中，以便于研究染色体的特殊结构，也 需要作预处理；其目的是使细胞的核外条件及染色体本身 的状态更适于分析和研究的需要。在细胞培养（培养基中 加有PHA）后72小时，合成DNA的细胞占总数的45％，有 丝分裂的速率相当于每小时1%，被激活的淋巴细胞占总 数的90%，是收获分裂期细胞、制备染色体标本的最佳时 期。从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、低渗处理、固 定、滴片等几个主要环节，现将各步骤的原理、所用试剂 及相关注意事项详述如下。