QIAGEN试剂盒提取DNA步骤

QIAamp DNA Micro HandbookZhang weiCarrier RNA的作用：它可以提高DNA和柱子的结合能力，尤其是对于低目标分子的样本来说。

如果加入了Carrier RNA，那么最后洗脱下来的产物中会有目的DNA和Carrier RNA。

而且Carrier RNA的量远远大于DNA的量。

因此，通过计算初始加入多少CarrierRNA 的量来确定后续实验中所需要使用的洗脱产物的量。

加入310uLBuffer AE到310ug的Carrier RNA干粉末中，充分溶解，存于-20℃保存，不要反复冻融在3次以上。

轻轻的将Buffer AL和溶解的Carrier RNA混匀，不要产生泡沫。

含有Carrier RNA的Buffer AL可以在常温下（15-25℃）放置48h。

事先溶液准备Buffer ATL如果出现沉淀，可以在70℃下溶解。

Buffer AL如果出现沉淀，可以在70℃下溶解。

Buffer AW1加入25mL无水乙醇。

Buffer AW2加入30mL无水乙醇。

加入Carrier RNA：小量血液提取DNA过程中，每100uLBuffer AL加入1uL溶解的Carrier RNA。

在微量组织中提取DNA中，200uLBuffer AL中加入1uL Carrier RNA。

微量血液中提取DNA（可以从1-100u1-100uL L 血液中提取基因组DNA）（微量细胞的基因组DNA提取可以使用该步骤）1)吸取100uL血液加入1.5mL离心管中2)加入Buffer ATL至最终体积为100uL3)加入10uL蛋白酶K4)加入100uLBuffer AL，关上盖子，涡旋15s5)56℃孵育10min（孵育时反复震荡几次可以增加DNA产出量）6)简单离心，甩下瓶盖上的液滴1)加入50uL无水乙醇，关上盖子，涡旋15s，室温孵育3min（如果室温超过25℃，无水乙醇可以事先冰浴）7)简单离心，甩下盖子上的液滴8)将上步的液体转移至吸附柱里，6000×g（8000rpm）离心1min，弃滤液（个人建议可以将滤液再次吸回吸附柱内在洗脱一次）9)在吸附柱里加入500uL Buffer AW1，6000×g（8000rpm）离心1min，弃滤液10)在吸附柱里加入500uL Buffer AW2，6000×g（8000rpm）离心1min，弃滤液11)空转20000×g（14000rpm）离心3min12)将吸附柱转移至干净的1.5mL离心管，在膜上小心加入20-100uL BufferAE或者双蒸水来溶解，室温放置1min，20,000×g(14,000rpm)离心1min。

QIAamp DNA Blood Mini Kit简介：QIAGEN公司出品的QIAamp DNA Blood Mini Kit适用于使用微型离心机或真空处理从全血、血浆、血清、血沉、淋巴细胞以及体液样品中提取总(基因、线粒体和病毒)DNA。

该试剂盒可处理带有EDTA、柠檬酸盐和肝素等常规抗凝剂的新鲜或冷冻的全血样本，样品量可达200μl。

整套基因组的操作时间约为20–40分钟，一般可从200μl健康全血中获得4–12 μg DNA，洗脱体积可在50–200μl范围。

抽提原理：样品中的DNA可以特异性结合到QIAamp的硅胶膜上，通过两次洗涤可以将PCR抑制剂，如：二价阳离子和蛋白完全去除，最后结合在离心柱上的纯核酸可用水或试剂盒中的缓冲液进行洗脱收集。

开始前的注意事项：1. 所以的离心步骤需要在室温（15-25℃）进行2. 如果样品中含有的基因组当量少于10000，请添加载体DNA（carrier DNA）3. 200μl全血样品可以得到约3-12μgDNA开始前的准备工作：1. 将样品平衡到室温（15-25℃）2. 将水浴或是金属浴加热到56℃，以备第4步使用3. 将Buffer AE或蒸馏水平衡到室温，用于第11步的洗脱4. 确保Buffer AW1、AW2以及QIAGEN蛋白酶已经按照说明配置完毕5. 如果在Buffer AL中出现沉淀物，请在56℃孵育使其溶解操作步骤：以下为整个基因组提取操作的流程图，由于真空装置并非所有的实验室都配置，所以这里介绍的是离心法（流程图左侧）。

以下译介自QIAGEN官方出品的说明部分，黑粗体为实验操作的主体部分。

1. 吸取20μl QIAGEN蛋白酶（或者蛋白酶K）至1.5ml离心管的底部。

2. 加入200μl待提取基因组的样品至离心管中。

可以加入不超过200μl的全血、血浆、血清、血沉棕黄层，或者溶于200μl PBS中不超过5*106的淋巴细胞。

如果样品体积不足200μl，请使用PBS补足。

一、试剂盒法精提DNA1、先用1ml生理盐水（NS）洗菌，使管内抗原在NS中充分混匀，8000rpm，3min 离心，弃上清，只留沉淀。

2、向管中加180ul的ATL和20ul的蛋白酶K，混匀，放入56℃金属浴（带摇匀功能的金属浴箱）3h。

3、如要去除RNA，向体系中加4ul的RNA酶，震荡，室温离心2min，使液体全部进入管内，向样品中200ul的AL，混匀，震荡，在金属浴中放置10min（70℃）之后离心。

或4、如不去除RNA，则直接向样品中加200ul的AL，震荡混匀，在金属浴中放置10min（70℃）之后离心。

5、加200μl的乙醇（96%～100%），混匀后短暂离心，将盖上液体离下（全部体系包括沉淀全加柱子上）。

6、全部管内的液体及白色沉淀都加入所试剂盒提供的带柱子的管中。

注意不要碰到管的边缘，盖好管盖，8000rpm离心1min，之后将柱子转移到新的管中（试剂盒提供）。

7、向柱子中加500ul的AW1，盖好管盖离心（8000rpm，1min）之后将柱子转移到新的管中（试剂盒提供）。

8、向柱子中加500ul的AW2，盖好管盖最大转速离心（13800rpm，3min）。

9、换普通的EP管，最大转速下空离3min，确保杂质都不留在柱子上。

10、换普通EP管，开盖晾5~10min，向柱子加200μl的AE，室温放置1min，离心（8000rpm，1min）。

11、在分光光度计上测所提取核酸的浓度。

使用ND-1000V3.2.5软件测DNA浓度（Nucleic Acid）。

在使用分光光度计前用O启该软件的使用，以后每次加样时用纸沾干净之前所加样品。

用溶解核酸ddH2的溶剂调 Blank，使之显示读数为0。

之后加样测浓度（注：每次加样时都要在混匀器上将样品充分混匀。

）测好浓度后在管盖及管壁标明编号、日期和所测核酸的浓度。

必要时电泳看是否真正的提出了核酸。

12、将所提核酸保存在-20℃的冰箱中备用.可以再用水溶一次，水溶模板用于多重PCR鉴定；AE溶模板一般用于测序。

全血DNA 抽提(QIAGEN，德国)
采用血液基因组DNA 提取试剂盒按说明书进行操作，简述如下：
(1)先将无水乙醇加到漂洗液PW 和缓冲液GD 中，并将血液标本置于室温下平衡至标本完全溶解。

(2)取经RNaseA 酶处理过的离心管，按顺序编号后加入500μl 混匀的标本，随后
加入细胞裂解液CL lml，充分混匀后10000rpm 离心1min。

弃去上清，留下细胞
核沉淀。

(3)加入200μ1 缓冲液GS，振荡混匀。

随后加入20μ1 蛋白酶K 溶液，充分混匀。

加缓冲液GB 200μ1，充分混匀后，56℃水浴10min 至溶液变清亮。

取出后，加
无水乙醇200μl，混匀。

(4)上部物质转移到吸附柱内，12000rpm 离心30s。

弃去液体，并将吸附柱CB3 套在收集管上。

(5)加入500 μl 缓冲液GD，12000rpm 离心30s，弃去液体，将吸附柱CB3 放入收集管中。

(6)加入700μl 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃去液体，将吸附柱CB3 放入收集管中。

(7)加入500μl 漂洗液PW，12000rpm 离心30s，弃去液体。

12000rpm 继续离心2min，弃去液体。

并把吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干吸附材料中的漂洗液。

(8)将吸附柱套上一个干净的离心管中。

向吸附膜中间位置悬空滴加80μl 洗脱缓冲液TB，室温放置5min，12000rpm 离心2min。

将溶液收集到离心管中并标号，置于-20℃冰箱中冻存备用。