神经干细胞体外培养技术

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大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究

一44一重庆医科大学学报2∞8年第33卷增刊l(J oum aI of C h ong qi ng M ed i caI U n．vers i ty2∞8．V o|．33No．s1)基础研究文章编号：0253—3626(2008)sl—0044—04大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究何梅-，王学峰，马珊珊：，席志芹(1．重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆400016；2．山西医科大学第一附属医院神经内科，太原030001)【摘要】目的：探索体外培养大鼠神经干细胞(N eur al st e m ceus，N s cs)的方法和实验条件，建立一种较为可靠的神经干细胞培养方法。

方法：分别选取孕14～16ds D胎鼠和新生1d的sD大鼠进行神经干细胞培养，采用单纯机械吹打和机械吹打加酶消化丽种方法进行消化，对培养出的细胞进行神经干细胞、神经元、神经胶质细胞的免疫细胞化学和免疫荧光鉴定。

结果：用2种来源的大鼠培养出的原代细胞，均表达N es t i n，诱导分化后的细胞表达G FA P和M A P-2。

结论：大鼠神经十细胞的原代分离与培养的关键是单细胞悬液的获得，消化液浓度太高或消化时间太长，容易因消化过度致细胞损伤甚至死亡。

胎鼠来源者神经球形成早，数量多。

增殖活力更强，但原代取材过程易被污染。

新生鼠来源者鼠源易获得，组织取材过程操作简单，但神经干细胞成球率低。

【关键词】神经干细胞；细胞培养；免疫荧光；免疫生化【中国图书分类法分类号】R74l【文献标识码】A【收稿日期】2007一08—29St udV on i soI at j on and cul t ur e O f neur aI s t em C e¨s f r O m r at br ai nH E M ei．e￡击0D epdr t m em《N e酣ol ogy，t k F订st A航l谴ed H ospi斌，C hongqi唱M ed记击U n洳er s畸)【A bst ract】O巧ec渤e：To es讪l i s h岫m em od of cul t ur i ng neur al哟m ceus(N s cs)妇n ra t brai n．胁跏ds：E14～16sD吣一br yoni cm￡brai n粕d pos t nat aJ one—da y(P1)r a t br aj n w e r e r es pecti vel y ch ose t o cul t l l r e ne u m l st e m ceU s，an d t’帕diges t ive m et h—ods t}l at s i m pk m e ch肌i ca l di ges t i on a nd m e chan i ca l com bi ned诵t}l che m i c al diges t主on w e r e u8ed t o det e兀ni ne t l l e bes t condi—t ions i n pr i m ar y cuhur e．I m m un∞yt oc hem i st I y and i m m u noⅡu or e sce nc e w er e us ed t0i dent i母N SC s，ne urons a nd neum di al cel l s．R8s饿捃：B o t h t l l e pri m a巧ceu s f r o m t w o dⅢbr ent ki nds0f ra t bm i ns ex pr es sed nes ti n aJ l t i g en粕d t}l e di任br en t i ated cel l s ex—pr e ssedG F A P锄d M AP一2明t i gen．∞似砌6s暮D竹：ne key poi nt of pr i m ar y N SC s cul t ur e w鹊obt ai ni ng t he m on叩l鹊t s u叩ens i on．0ver di gest i on l ed t o c eu i nj u r y ev en de am．N SC s舶m em br yoni c ra t br ai n had bet t er pm l i f er at i on abi l i t y粕d co ul d f0肌ceⅡcl ones ea r l i er粕d m or e t}I an N SC s f南m new b om E a t br ai n，but t11e y w e r e e鹊i er t o be contam i nat ed．0h t ai n i ng new b om m t bm i n锄d i sol ati on N SC s舶m new bom ra t br ai n w er e e鹊i er，b ut N SC s舶m new bom ra t br ai n had w o璐e pm l如m t i on abi l吼【K ey w or ds】N eur al st e m ce ns；ceu cu l t u r e；I m m un onu or esc enc e；I m m uno cyt o che m i st r yN S cs是一种原始的未分化细胞，它有和成熟神经细胞相同的基因，且具有自我增殖和多向分化的潜能，神经干细胞研究是21世纪生命科学研究的重要领域。

生物医学研究的体外和体内模型技术进展及其应用

生物医学研究的体外和体内模型技术进展及其应用随着生物医学研究的深入，对于疾病的研究不能仅仅依靠临床数据和动物实验。

由于人体复杂的生理结构和环境，以及道德、法律和安全等限制，单一实验手段已经无法满足研究需要。

因此，体外和体内模型技术成为了现代生物医学研究的重要手段，得到了广泛关注和应用。

一、体外模型技术体外模型，也称为细胞系、细胞培养模型或体外实验，指的是直接人为将动植物组织或细胞分离、培养和鉴定，以模拟疾病的发生和病理生理变化。

相对于体内模型技术，体外模型技术具有优越的灵敏度、可重复性和便携性。

1. 原代细胞培养技术原代细胞培养毫无疑问是最早发展的体外模型技术之一，包括从组织中分离的原代细胞和从血液样品中分离的外周血单个核细胞。

此外，通过对干细胞、胚胎干细胞等特殊细胞进行培养，不仅可以推动干细胞与组织再生领域的开展，还可以帮助研究人类早期胚胎发育和诊断遗传性疾病。

2. 三维细胞培养技术与传统平板式培养技术不同，三维培养技术可以模拟更加真实的生物环境，对于某些生物医学研究领域具有独特的优势。

例如，人类肝细胞和心肌细胞，平时因为生长环境的不同，难以在二维培养环境模拟其生存环境，使用三维培养技术可以解决这个问题。

此外，三维培养技术也可以实现人体细胞与细胞之间的组织工程修复。

3. 利用基因工程技术构建体外疾病模型基因工程技术的广泛应用，使得构建许多体外神经退行性疾病模型成为可能。

研究人员通过对细胞进行特定基因的转化和敲除，模拟疾病的发生和病理生理变化过程，从而可以研究疾病发生机制与治疗方法等问题。

此外，利用不同的基因修饰策略，还可以构建多种类型的疾病模型。

二、体内模型技术相对于体外模型技术，体内模型技术更加完整地模仿了真实场景。

与此同时，体内模型技术在很多情况下具有更高的预测能力。

但由于种种原因，体内模型技术的研究成本和难度也更高。

1. 动物模型动物模型是体内模型技术最传统和常见的方法，对于很多疾病的研究和药物安全性测试都得到了广泛应用。

Y27632对体外培养的大鼠神经干细胞增殖和分化的影响的开题报告

Y27632对体外培养的大鼠神经干细胞增殖和分化的
影响的开题报告
一、研究背景
神经干细胞是一类具有自我更新和多能分化潜能的细胞。

在生物医
学领域，神经干细胞的应用前景非常广泛，例如可用于治疗神经系统退
行性疾病和中枢神经系统损伤等领域。

因此，提高神经干细胞的增殖和
分化效率是研究的重点之一。

而Y27632是一种针对Rho激酶的抑制剂，具有诱导形态学改变、增强细胞粘附和改变细胞骨架等作用，因此被广
泛应用于细胞培养中。

本研究旨在探究Y27632对于大鼠神经干细胞体外培养的影响。

二、研究内容
1.探究Y27632对大鼠神经干细胞增殖的影响。

选取一定浓度的Y27632加入到大鼠神经干细胞培养基中，采用
MTT法检测细胞增殖情况，观察加入Y27632后神经干细胞增殖程度的变化。

2.探究Y27632对大鼠神经干细胞分化的影响。

将大鼠神经干细胞培养在不同剂量的Y27632培养基中，观察神经干细胞的分化情况，并运用Immunofluorescence染色和实时荧光定量PCR 等技术方法对各细胞类型进行鉴定。

三、研究意义
探究Y27632对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响，能为神经干细胞的体外培养提供新的方法和途径，进一步推进干细胞研究领域的发展。

同时，该研究还能为神经系统疾病和损伤的治疗提供有力的基础研究支持。

实验细胞-神经细胞

（一）神经胶质细胞培养
1．雪旺细胞：雪旺细胞是外周神经系统最主要的胶质细胞，也是外周神经的成髓鞘细胞；它形成髓鞘，或包裹轴突而不形成髓鞘。雪旺细胞的功能极其活跃，一旦神经受损，它能分裂增殖，分泌神经营养因子，产生细胞外基质和细胞粘附分子，对神经元及其轴突起营养和修复作用。近年来的研究表明，雪旺细胞也能促进中枢神经对脱髓鞘损伤的修复，如对脊髓的再生，对视网膜神经节以及对隔-海马通路再生等。说明雪旺细胞能改善中枢神经再生的微环境，因而近年来对雪旺细胞的研究，尤其是体外培养研究已成热点。
纯度鉴定可用胶质纤维酸性蛋白抗体（GFAP）染色确定。
（二）成年大鼠背根节神经元培养
● 材料和方法
取3-6 月龄的SD雄性大鼠。无菌剪取一段脊髓，背侧朝上于灭菌毛玻璃片上，在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨，暴露脊髓和神经节，取出神经节。置于含 1% 胶元酶(Collagenase)和1% 消化酶(Dispase)的 2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)。分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的细胞悬液；接种于涂有小牛皮胶或以小鼠脑皮层胶质细胞为背景的35mm塑料培养皿中，每皿置2ml细胞悬液。标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养g/ml和尿苷35μg/ml, 作用48小时后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次，每次更换一半新鲜饲养培养液。
雪旺细胞的生长和形态特征
培养15d后可获得较高纯度的雪旺细胞，雪旺细胞呈双
极梭状，核卵居中，相互平行排列，经S-100免疫组织化学染色呈阳性反应。增殖分裂的雪旺细胞可用于进一步传代培养，也可进行冷冻保存备用。

实用神经变性实验方法-成年鼠干细胞培养

实用神经变性实验方法----成年鼠神经干细胞培养神经干细胞具有自我更新和分化成中枢神经系统不同类型细胞的能力。

体外分离培养和分析神经干细胞是揭秘神经发生的细胞和分子机制的重要方法,也有助于神经系统疾病和神经损伤干细胞治疗的条件优化。

成年哺乳动物脑内神经发生主要集中在两个区域:侧脑室室下区( subventricular zone of the lateral ventricle,SVz) 和海马齿状回的颗粒下层( subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampusSGZ)。

SGZ区的神经干细胞主要产生海马齿状回兴奋性谷氨酸能神经元。

SVZ区的神经干细胞产生抑制性的￥-氨基丁酸能神经元和嗅球的多巴胺能中间神经元除了分化为不同的神经元外,这两个区域的神经干细胞对神经营养因子、神经生理和病理刺激的反应性也不同,然而,这两个区域神经干细胞具有不同特性的分子机制并不十分清楚。

因此,比较同一个脑组织中,这两个神经发生区域神经干细胞的特征显得尤为重要。

近些年来,国际上相关领域的专家一直都在优化成年鼠神经干细胞的分离培养条件,但仍然存在很多的不足之处,如贴壁单层生长的细胞容易分化、所需的鼠脑数量较多等。

本文将介绍一种从一只鼠脑中同时分离培养DG区和SVZ区神经干细胞的方法。

1.材料8~12周雌性或雄性C57BL6J小鼠、Hank's平衡盐溶液(HBSS,购自Invitrogen, 货号14025126)、Neurobasal培养基(购自Invitrogen,货号210-049)、DMEM/F12培养基(购自Invitrogen,货号1032、B27添加物(购自Invitrogen,货号1750404),N2添加物(购自Invitrogen,货号17502-408,无菌分装)、Glutamax(购自Invitrogen,货号35050-038,无菌分装)、L-谷氨酰胺(购自Invitrogen,货号2503081,无菌分装)、青霉素/链霉素Antibiotic-antimycotic,自Invitrogen,货号15240-062,无菌分装)、碱性纤维生长因子(bFGF-2,购自Peprotech,货号100-18B-B)、表皮生长因子(EGF,购自Pepo Tech,货号100-15)、MACS神经组织分离试剂盒(购自Miltenyi Biotec,货号130-092-628)、β-巯基乙醇(购自EM Sciences货号MX0O31OMB-1,属剧毒品,在通风橱中打开)、Percoll分层液(购自Amersham Biosciences,货号17-0891-01)、10×DPBS(购自Invitrogen,货号14200-059)、1×DPBS(购自Invitrogen,货号14190-136)、多聚鸟氨酸(Poly-L--ornithine,购自SigmaAldrich,货号P-3655)、层粘连蛋白( Laminin,购自BD biosciences,货号354232) 维甲酸( Retinoic acid,RA,购自Sigma-Aldrich,货号R2625)、毛喉素( Forskolin FSK,购自Sigma-Aldrich,货号F6886)、二甲亚砜( Dimethyl Sulfoxide,DMSO,购自Sigma-Aldrich,货号D2650),超纯水( Mini Q)、75%酒精、4%多聚甲醛、细胞消化液(购自Accutase)、磷酸盐缓冲液(PBS)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brom2-deoxy Uridine, Brd)2.仪器6cm和10cm直径的细胞培养皿,离心管,1ml带滤芯的吸头,超低黏附6孔和24孔细胞培养板;解剖工具[眼科剪(购白Roboz,货号RS-5840、RS-6942),眼科镊(购自Roboz,货号RS-5237、RS-5095)];解剖显微镜;MclⅡ组切片机(购自The Mickle Laboratory Engineering Co.LTD,货号10180)及刀片Macsmix离心管混匀器(购自Miltenyi Biotec,货号130-090-753);无菌试纸(购自Fisher Scientific,货号14-959-92B);低速离心机(购自Eppendorf,型号5702,货号022626001);数字相差倒置显微镜(购自Olympus,CK41)。

干细胞培养

干细胞体外培养的基础研究意义：干细胞体外培养为研究干细胞生物学和分子机制提供了机会。通过维持干细胞的自我更新能力和多向分化潜能，科学家们可以探索干细胞的起源、增殖机制和分化途径。此外，干细胞体外培养还可用于研究干细胞在不同环境因子下的行为和相互作用，揭示细胞信号传导和基因调控网络的复杂性。这些基础研究的成果有助于加深我们对干细胞生物学的理解，并为未来的应用研究提供坚实的基础。
结论：干细胞体外培养技术在再生医学领域具有重要的意义和潜力。它为基础研究提供了探索干细胞生物学的平台，为疾病研究提供了研究模型，并为组织修复和再生医学的应用开辟了新的道路。随着技术的不断发展和创新，干细胞体外培养将继续发挥重要作用，推动再生医学领域的进展，为人类健康带来无限的可能性。
干细胞培养
引言：干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞，对于再生医学和组织工程具有重要意义。干细胞体外培养技术的发展为科学家们提供了研究和应用干细胞的重要平台。通过在体外培养条件下维持干细胞的特性和功能，我们能够深入了解其生物学特性，并开展从疾病研究到组织修复的广泛应用。本文将探讨干ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞体外培养的意义及其在再生医学领域的潜力。
干细胞体外培养在疾病研究中的应用：干细胞体外培养技术为疾病的研究和药物筛选提供了重要工具。通过将患者来源的干细胞进行体外培养，科学家们可以模拟和研究多种疾病的发生机制和病理过程。例如，使用干细胞体外培养技术可以生成疾病特定的细胞类型，如心肌细胞、神经元和肝细胞，以研究心脏病、神经退行性疾病和肝病等疾病的发展机制。此外，干细胞体外培养还可用于评估药物的疗效和毒性，加速药物发现和开发过程。
干细胞体外培养在组织修复和再生医学中的前景：干细胞具有巨大的再生潜能，可以分化成多种细胞类型，并在组织修复和再生过程中发挥重要作用。干细胞体外培养为组织工程和再生医学提供了关键技术支持。通过将干细胞体外培养并定向分化成特定细胞类型，科学家们可以生成可用于移植的特定组织和器官细胞，如心脏组织、胰岛细胞和骨组织。这种个体定制的再生医学方法有望为疾病治疗和组织修复提供更有效的解决方案。此外，干细胞体外培养还可以用于开发新型材料和生物支架，用于组织工程和再生医学的应用。

人神经干细胞体外诱导分化及在体裸鼠胃肠道的移植

李志强，段丽萍，沈丽
１０９；．０１１２北京大学干细胞研究中心）（．１北京大学第三医院消化科，北京［摘
要】目的：探索人神经干细胞体外诱导分化，以及在体移植入裸鼠（免疫缺陷小鼠）幽门部后的存活及分化
状况。方法：ｌ取Ｏ周左右流产人胚胎神经干细胞，体外悬浮培养、传代和诱导分化，用免疫荧光方法检测神经干细胞标志物神经上皮干细胞蛋白（ｅｔ）肠道神经细胞标志蛋白基因产物９５ｐｏｉｅｅｐｏｕｔ．，ＰＰ．）ｎｓｎ、ｉ．（ｒｔｎｇｎｒｄｃ９５Ｇ９５ｅ和神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（ｌｌｂｉａｃｉｐｏｉ，ＦＰ；ｇｉｒｌｙａｉｃｒｔｎＧＡ）取体外悬浮培养３个月的人神经干ａｆｌｒｄｅｉ细胞移植入裸鼠的幽门部，检测神经干细胞在幽门局部的存活和分化状况。结果：免疫荧光染色显示体外培养的
北
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学
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（医
学
版
）
６４・２
ＪＵＮＬＯＥＩＧＵＩＥＳＴ（ＡＬＨＣＥＣＳＶ１４Ｎ．Ｄｃ０８ＯＲＡＦＰＫＮＮＶＲＩＹＨＥＴＳＩＮＥ）ｏ．０ｏ６ｅ．２０
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论著
・
人神经干细胞体外诱导分化及在体裸鼠胃肠道的移植
ｍｉｅｃ
ＬＩＺｈ — ｉｎｇｉｑａ，ＤＵＡＮ — ｉ，ＳＨＥＮＬｉｐｎｇＬｉ
（．ｅａｔｎｆａｔｅｔｒｏｙＰｋｎｎｖｒｉｈｒｏｐｔｌｅｉｇ１０９，ｈｎ；．ｅｉｇＵｉｅｉｔｍ１Ｄｐｒｔｓｏｎｅｌｇ，ｅｉｇＵｉｅｔＴｉＨｓｉ，Ｂｉｎ０１１Ｃｉａ２ＰｋｎｎｖｒｔＳｅｍｅｏＧｒｏｓｙｄａｊｓｙＣｌＲｓａｃｅｔ）ｅｅｅｒＣｎｒｌｈｅ

神经干细胞原代取材与培养

神经原代干细胞的取材及培养长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。

因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。

神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。

一、神经干细胞神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。

原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。

神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。

②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。

③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。

总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。

二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养1.原代取材（1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。

（2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。

（3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。

重复2-3次。

（4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。

用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。

（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

【ｂｔｃ０ｊｃｉｏｅｐｏｅｍｔｄｏｉｌｉ，ｕｉｔｎａｄｄｆｅｔｔｎｏｕａｔｅｒｌｔｅｓＡｓａｔｂｅｔｅｘｌｅｔｅｏｓｆｓａｏｃｌａｏｎｉｅｎａｏｆｍｎｆａｎｕａｓｍｃｌ，ｒ】ｖＴｒｈｈｏｔｎｔｉｖｆｒｉｉｈｅｌｅｌ
ｓｒｍｆｅｍｅｉｍｃｎａｎｎａｉｆｒｂａｔｒｗｈｆｃｒ（Ｆ）ｎｐｄｒｌｒｗｈｆｃｏ（Ｇ）ａｓｄｔｕ— ｅｕｅｄｕｏｔｉｉｇｂｓｂｏｌｓｇｏｔｔｈＧＦａｄｅｉｅｍａｇｏｔａｔｒＥＦｗｓｕｅｏｅｌｒｃｉａｏ
ＦＮｉｇＨＵＱｎｆＹＮＧｏａＣＥｉｈｎＡＧＱｎＺｉｅｇｎｌｕｃｉＨＮＸｎｅ￣２ｓ
１ＤｅａｔｎｆＮｅｒｓｒｅｙＡｎｉｇＨｏｐｔｌＡｆｉａｅｏＡｎｕｄｃｌＵｎｖｒｉ，Ａｎｕｒｖｎｅ．ｐｒｍｅｔｏｕｏｕｇｒ，ｑｎｓｉｆｉｔｄｔｈｉＭｅｉａｉｅｓｔａｌｙｈｉＰｏｉｃ，Ａｎｉｇ２６０，ｑｎ４０３
Ｃｈｎ；．ｐｒｍｅｔｏｉｃｅｃｓｉａ２ＤｅａｔｎｆＬｆＳｉｎｅ，ＡｎｉｇＮｏｍａｉｅｓｔ，Ａｎｕｏｉｃ，ｑｎ２６０，ｉａｅｑｎｒｌＵｎｖｒｉｙｈｉＰｒｖｎｅＡｎｉｇ４０３Ｃｈｎ
２２９第卷２０年月９第７１期
・论
著・
人胎脑神经干细胞的体外分离、养与鉴定培

利用体外培养技术进行神经组织工程的步骤

利用体外培养技术进行神经组织工程的步骤体外培养技术是神经组织工程中的一项重要技术，它可以模拟体内环境，培养和维持神经组织的生长和发育。

下面将介绍利用体外培养技术进行神经组织工程的主要步骤。

第一步：细胞来源的选择在神经组织工程中，细胞来源是非常重要的。

常用的细胞来源包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPSCs）和成年组织的干细胞等。

胚胎干细胞和iPSCs具有较强的多向分化能力，可以分化为神经元和神经胶质细胞。

成年组织的干细胞则可以从体内获取，如脑组织和骨髓等。

第二步：细胞分化的诱导通过添加特定的生长因子和培养基成分，可以诱导细胞向神经细胞系列分化。

例如，添加神经营养因子（如神经营养因子-3和神经生长因子）可以促进神经元的生长和分化。

此外，还可以通过转染特定基因来诱导细胞分化为特定类型的神经元，如谷氨酸能神经元或多巴胺能神经元等。

第三步：细胞的扩增在细胞分化后，通常需要进行细胞的扩增，以获得足够数量的细胞用于组织工程。

细胞的扩增过程中需要注意细胞的稳定性和无菌操作，以保证细胞的纯度和活力。

第四步：三维组织工程的构建三维组织工程是神经组织工程的重要手段之一。

通过将细胞种植到具有特定结构和支架材料上，可以形成三维的组织结构。

常用的支架材料包括天然生物聚合物（如胶原和明胶）和人工合成聚合物（如聚乳酸和聚己内酯）。

这些支架材料不仅可以提供细胞黏附和生长的支持，还能够模拟体内组织的物理特性和生物化学信号。

第五步：生物反应器的使用为了模拟体内环境，通常需要使用生物反应器来提供适宜的气体、温度、pH 值和营养物质供给等条件。

生物反应器可以提供稳定的培养环境，并且可以调节培养条件以促进细胞生长和发育。

第六步：细胞的成熟和功能评估在组织工程过程中，细胞的成熟和功能评估是非常重要的。

通过检测细胞的形态、细胞间连接、细胞信号传导和相关基因表达等指标，可以评估细胞的成熟度和功能。

此外，还可以通过外界刺激（如电刺激、化学刺激）来检测细胞的响应能力和功能。

神经干细胞的体外培养及其DCX的表达

【摘要】目的：研究神经干细胞体外培养、分化及其ＤＣＸ的表达。方法：体外分离培养神经干细胞，传３代后通过免疫组织化学染色鉴定干细胞及分化的细胞，并观察其ＤＣＸ的表达。结果：ＳＤ大鼠海马和脑室下区组织体外培养的细胞为神经干细胞，ＤＣＸ在干细胞中有表达，在其分化的神经元中无表达。结论：ＤＣＸ在神经干细胞中表达，在神经元无表达。【关键词】神经干细胞；体外培养；ＤＣＸ
细胞中的表达。Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎ（ＤＣＸ）在干１材料与方法
１．２．１神经干细胞的培养取新生ＳＤ大鼠海马和脑室下区组织，用眼科剪剪碎，巴士
德吸管反复吹打至浑浊，冰上静置ｌｍｉｎ后，
ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，ｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ３ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．ＴｈｅｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＣＸｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＤＣＸｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎｔｈｅｎｅｕｒａ１ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｕｔｏｎｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｘｐｒｅｓｓＤＣＸａｓａｓｐｅｃｉｆｉｃｍａｒｋｅｒ．

神经干细胞——精选推荐

神经生物干细胞定义干细胞是指机体在其毕生过程中、某些特定时期具有自我更新(self-renewal)和分化(differentiation)能力的细胞群。

干细胞也称前体细胞(precursor cell)或祖细胞(progenitor cell)。

干细胞的概念最早由Evans于20世纪80年代初提出，他们在实验中发现来源于小鼠囊胚的内皮细胞团，能在体外培养，是一种高度未分化的细胞，具有发育成为各种细胞的潜能，一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。

干细胞具有两个基本功能：多种潜能和自我更新能力。

按照分化潜能的大小，干细胞可以分为3种类型：(1) 全能干细胞(totipotent stem cells)，能产生机体任何细胞类型，进一步形成机体的组织、器官并形成个体，如胚胎干细胞能够产生来自所有3个胚层的细胞，依所在组织不同而特化为不同类型的细胞；(2) 多能干细胞(multipotent stem cells)，这种细胞具有分化为多种组织细胞的潜能，但是不能形成个体，发育潜能受到一定限制，最典型的例子是骨髓造血干细胞；(3) 单能干细胞(unipotent stem cells)，常指成体中的细胞，这类细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，能够保证组织的稳定自我更新，补充因正常衰老或损伤而丧失的细胞，如上皮组织基底层的干细胞。

总之，生命体通过干细胞的分化增殖来实现细胞的更新及保证持续生长。

1、神经干细胞的定义1989年，Temple等从13天大鼠胚胎脑隔区取出细胞进行培养，发现这些细胞发育成神经元和神经胶质细胞。

其后从成年鼠纹状体、海马齿状回等处分离出能在体外不断增殖，并具有向神经元和星形胶质细胞分化潜能的细胞群。

20世纪90年代初，Reynolds 等从成年小鼠脑纹状体分离出能在体外不断分裂增殖，具有多种分化潜能的细胞群，正式提出了“神经干细胞”的概念，以一种新的观念代替了传统的认为神经组织一成不变的观念。

大鼠神经干细胞体外培养的研究

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识，为神经系统损伤及变性类疾病开辟了一种全新也的治疗途径。随着神经干细胞研究广泛深入地开展，神经干细胞的分离培养技术已经成功地建立起来，并逐渐成为体外获得神经干细胞体系的主要方法。２００８年１５月本实验通过比较机械吹打法及胰酶消化法 — 两种条件下ＮＣ的增殖、化情况，化培养方法，Ｓｓ分优为
镜下见原代培养的ＮＣ克隆长到约１０Ｓｓ０ｍ大小时用以下两种不同的分离方法进行分组传代培养：
（）械吹打组：培养基和细胞克隆团一起用吸管１机将
转移到离心管内，００ｒｍｎ１０ｉ离心５ｍｎ弃上清液，／ｉ，加
ｔｌｌｔｎｃｌｐｏｅＮｓｎ）ｎｕｏｅｉｃｎｌｓＮＥ，ｌｌｌＨｌｙａｉｉｐｏｅＧＡ）ａｄｃｃｃｕｈｉｅｅｌｒｔｎ（ｅｔ，ｅｒｎｓｃｏｅ（Ｓ）ｇａｆｌｒｃｄｒｔｉｅａｓｉｉｉｐｆｅａｉｉｂａｃｎ（ＦＰｎｙｌ — ｉｎｃｅｔｅｐｏｐｏｙｒｌｅ（Ｎ）ｅｕｔＴｅｃｌｏａｄｆｍｎｏａｌＤｒｔｐｓｅｓｅａｉｔｔｐｏｆｒｅｌｉｈｓｈｈｄｏｓＣＰ．ＲｓｌｈｅｓｉｌｅｒｅｎｔａｏｓｓｅｔｂｉｒｌｅａｏｄａｓｌｓｔｏａＳｓｄｈｌｙｏｉｔ

神经干细胞再生与体外培养的实验研究

神经干细胞再生与体外培养的实验研究近年来，神经系统疾病已成为世界范围内重要的健康问题之一。

例如，阿尔茨海默病、帕金森氏症和脊髓损伤等疾病，对患者日常生活造成了严重的影响。

虽然目前有许多药物和治疗方法，但是很难完全治愈这些疾病，于是，神经干细胞再生的实验研究成为治愈神经系统疾病的一个新方向。

神经干细胞是一种具有自我更新和多线分化潜能的细胞。

这些干细胞能够分化成各种类型的神经细胞，包括神经元（神经细胞）和神经胶质细胞（支持细胞），并且有望重建损伤的神经组织。

具有自我更新潜力的神经干细胞可以通过细胞分裂不断产生更多的神经干细胞。

而分化潜力可以让神经干细胞，根据特定环境信号分化成一定类型的神经细胞。

在实验室中，神经干细胞的繁殖和分化可以通过体外培养来实现。

体外培养是指将细胞从其体内环境中分离出来，然后将其放置在好氧、无菌的环境中，加入一定的营养因子和细胞因子，提供良好的培养条件，使其生长、分裂，发挥其自我更新和多向分化的能力。

对于神经干细胞的体外培养，关键是要选择一种可以维持其自我更新和多向分化潜能的培养基。

目前，文化基础通常包括一种有机物，如人工合成物MS5和培养基B27，以及一种因子交联的蛋白质或培养基因治疗。

这些因子可以提供正确的信号和良好的环境，激活神经干细胞的分裂和分化。

另外，神经干细胞在培养时，还需要种植在一种支持细胞或未分化的神经细胞上，以提供必要的生长因子和支持。

在干细胞培养和分化的过程中，各种因素的运用互相协作，最终实现了神经干细胞的分化成为神经元和神经胶质细胞。

神经干细胞的再生研究，也可以辅助治疗神经系统疾病。

例如，通过研究神经干细胞在修复损伤后的体外和体内表现，社会上已经能够开发出一些神经干细胞的移植技术。

但是，目前这种技术的应用还面临一系列问题。

例如如何均等的种植神经干细胞、如何让其更好的定位和分化、如何减少免疫抑制剂和避免移植后的排异反应，以及如何克服治疗效果的耐受性等。

随着技术的进步，这些问题的解决将极大地推动神经干细胞和再生医学的发展。

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神经干细胞体外培养与鉴定一前言神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。

文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。

此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。

根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。

基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。

本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。

二实验所需仪器、试剂及其配制（一）实验仪器光学显微镜（Olympus,Japan）倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB）冰冻切片机（Leica CM1900，Germany）光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂）XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司)10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLINGCORP，BATON ROUGE，LOUISIANA，Made in USA）0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff）手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。

（二）试剂1. DMEM/F12，Hank's液（Hyclone），N2（Gibico），bFGF（Invitrogen）。

2. 碳酸氢钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钾，氯化钠，多聚甲醛等为国产分析纯试剂，谷氨酰胺，青霉素，链霉素。

（三）主要试剂的配制1. 基础培养基DMEM/F12 1:1的配制DMEM粉剂 1.34g，F12 1.06g。

（1）称取以上试剂量后放入200ml烧杯中。

（2）加三蒸水至200ml搅拌溶解。

（3）用1mol/LNaOH或 1mol/LHCl调pH值为7.20。

（4）过滤分装，置4℃冰箱保存。

2. D-Hanks液（g/L）的配制KCl 0.40g，KH2PO4 0.06g，NaCl 8.00g，NaHCO3 0.35g，Na2HPO4·7H2O 0.09g，酚红 0.01g。

（1）称取以上试剂量。

（2）取1000ml烧杯盛约700ml三蒸水，依次加入所称试剂量溶解。

（3）再加足水至1000ml。

（4）用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH值为7.20。

（5）过滤分装，置4℃冰箱保存。

3. 抗生素液配制青霉素 1×106 IU/甁，链霉素 1g/瓶。

加入0.9%无菌的生理盐水50ml，即可配制成青霉素浓度为2×104 IU/ml，链霉素浓度为20mg/ml液体，无菌分装，-20℃保存，使用时稀释成青霉素工作浓度为100IU/ml、链霉素为100μg/ml。

4. bFGF-20℃保存，使用时用三蒸水稀释至20ng/ml的工作浓度。

5. 3.6%水合氯醛溶液的配制：称取3.6g水合氯醛置于250ml量筒中，加入少量无菌生理盐水溶解后定容至100ml。

6. 培养液的准备DMEM/F12 1:1 100mlGB液9ml 混合后，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，双抗（青、链霉素）各0.25ml 每瓶分装为10-20 ml，4℃储存。

bFGF 2 μgB27 1ml7. 4%多聚甲醛磷酸缓冲液的配制：称取40g多聚甲醛置于1000ml烧杯中，加入0.1 mol/L PBS 800ml，60℃加热至多聚甲醛完全溶解为止，冷却后滴加1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH溶液，用PHS-3C型精密pH计调整pH值在7.2-7.4之间，添加0.1 mol/L PBS定容至1000ml，4℃冰箱内保存备用。

8. 铬明胶溶液的配制：分别称取5g明胶和0.5g铬明矾，用60℃ 800ml左右的单蒸水先溶解明胶后，再加入铬明矾，待完全溶解后定容至1000ml，过滤，用于包被玻片。

包被时将玻片浸入60℃的铬明胶溶液中15-20min，取出后37℃烤干备用。

9. 20%、25%、30%蔗糖溶液的配制：分别取蔗糖20g，25g，30g，分别用0.1 mol/L PB缓冲液溶解后，定容至100ml。

三实验步骤（一）神经干细胞悬液制备取孕E12～14d的GFP转基因小鼠，用75％乙醇浸泡消毒GFP转基因孕鼠。

无菌条件下，剪开腹部皮肤及皮下筋膜，暴露并分离子宫，取出子宫，将其放入含D-Hanks液的培养皿中清洗。

用剪刀，镊子分离胎鼠（10∼12d），取其头部，在解剖显微镜下用纤维剪，镊暴露大脑, 无菌条件下分离脑膜获取海马, 制成1mm3组织块，剪碎并反复吹打制成细胞悬液，加入DMEM/F12 1:1（Hyclone）培养液（其中添加1％N2（Gibico），20μg/L bFGF（Invitrogen），2mmol/L谷氨酰胺，50000U/L青霉素，50mg/L链霉素），用吸管吹打20－30次，细胞滤网过滤后制成单细胞悬液，（二）细胞计数1. 取10μl细胞悬液，加入1%台盼蓝试剂计数存活细胞，计算细胞总数。

具体操作方法为：用10μl的移液枪吸取细胞，让枪头在盖玻片上或下侧的计数板凹槽处流出悬液，至盖玻片下被液体充满为止。

3. 置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。

对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。

4. 按下式计算细胞悬液的密度：细胞密度=（4大格细胞总数/4）×10000（个/ml）。

按此公式，测得细胞密度。

（三）神经干细胞培养调整细胞浓度为5×105个/ml，加入无血清的NSCs培养基，成份为DMEM/F-12 1:1(Hyclone)，添加1％N2(Gibico)，20μg/L 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Invitrogen)，2mmol/L谷氨酰胺，10000U/L青霉素，10mg/L链霉素。

接种于24孔培养板，37℃ 5%CO2培养箱培养。

隔日半量换液1次。

2d即可见有漂浮的神经球形成（图1），5d左右神经球增大，数量增多（图2），传一代后，NSC形态与原代类似（图3）。

（四）培养神经干细胞的鉴定根据文献报道（LIU Shi-yong，et al. 2000），我们用针对培养细胞的特异染色抗体Nestin来鉴定培养细胞。

分别将培养纯化的神经球涂于多聚赖氨酸溶液（40g/L）包被的载玻片上制成涂片。

用4%多聚甲醛固定15~20min，0.01mol/LPBS漂洗3次，每次5min；按文献报道的免疫组化两步法（Zhai JW, et al. 2010）染色鉴定细胞。

具体方法简介如下：3%H2O2避光处理30min以灭活内源性过氧化物酶，0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min；0.3%TritonX-100 37℃孵育30min；5%羊血清37℃孵育30min以封闭非特异性结合位点；滴加兔Nestin 一抗（Chemicon, 1:100），另一组只滴加0.01mol/L PBS为阴性对照组。

4℃湿盒孵育过夜，0.01mol/L PBST漂洗3次，每次5min，加入酶标羊抗兔IgG（二抗，1:100），37℃孵育30min，0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min；DAB显色3~5min 后,用单蒸水终止显色，脱水、透明、裱片，在普通光学显微镜下观察阳性反应产物部位并拍照。

四实验结果（一），NSC形态学源于海马的单细胞悬液后接种在24孔培养板1h后，即有细胞贴壁，单个细胞呈球形。

24h后见一些贴壁的扁平细胞，立体感较差，透亮度一般，这些一般是成纤维细胞。

此时将培养液放入另一培养板中继续培养，3d后离心收集细胞并在细胞内加入培养液继续培养。

NSC生长特性为悬浮生长，3d即可见一些克隆球，5d增大，传一代时已较纯。

（图 1A,B）（二），NSC组化染色鉴定结果本实验用Nestin免疫组化染色鉴定NSC ，源于GFP的NSC本可发绿色荧光（图2），Nestin染色呈阳性反应(图3)。

（三）结果分析与讨论本实验显示：培养的神经球呈Nestin免疫染色阳性，说明阳性细胞是NSC。

神经干细胞是一类未成熟细胞，选择性地表达某些抗原标志如巢蛋白(Nestin)。

巢蛋白属中间丝蛋白。

是目前作为神经干细胞的标记分子。

Nestin的表达起始于神经板的形成，在神经迁移及神经分化开始后逐渐消失，因而利用Nestin的抗体标记成为我们证明所分离细胞为胚胎早期细胞的重要方法之一。

Schmidt-Kastner 等（Schmidt-Kastner, et al. 2002）在实验中发现从培养2～8周的成年大鼠脑组织切片中可见Nestin持续呈阳性表达，这说明组织中出现了幼稚的神经干细胞。

本实验取胎鼠海马组织进行培养，在显微镜下观察可见圆形细胞团，由数十至数百个细胞组成，免疫组化染色见Nestin阳性，证明培养细胞确为神经干细胞。

关于NSC在体外的生长形态，已有不少文献报道，NSC在培养液中呈漂浮的克隆球生长特性。

最开始接种的细胞单个散存，胞体直径小，一般大约在10μm 左右。

通过24h培养使成纤维细胞等贴壁后，再取出细胞悬液培养，从而使细胞得到纯化。

其内的漂浮细胞继续生长，培养5d可形成较大的神经球。

从本实验结果看，我们所培养的细胞具有NSC生长特性，与文献报道结果一致【】。

加之之前用Nestin染色结果证明培养的细胞表达Nestin抗原，因此说明培养的细胞是NSC，可用于后续实验。