下载文档原格式
第五章生物药物的酶学分析法酶学分析法原理：利用酶作为分析工具，测定样品中待测物质含量的方法称作酶法分析。
待测物质应是酶的底物，或者是酶的抑制剂、活化剂或酶的辅因子，否则不能采用酶法进行分析检查。
酶法分析可分为终点法和反应速度法。
（一）终点法，又称总变量法基本原理：利用酶的生物催化反应，使待测物质发生转化，然后测定产物产量或底物残余量，通过定量分析，从而明确待测物质的含量。
可以是单酶反应，也可以是几种酶构成的偶联酶反应。
在生物药物分析中，终点法是最常用的酶法分析。
终点法的条件必须有专一地作用该被测物质的酶，并能得到它的制品。
能够确定使这种酶反应接近进行完全的条件。
反应中底物的减少或产物的增加或辅酶物质的改变等可以借助某种简单的方法进行测定。
在能满足这些条件的情况下，最好是采用单一酶反应就能进行定量检测。
使用终点法应注意的问题1．酶的底物专一性：绝对专一性相对专一性立体异构专一性对于酶法分析来说，最理想的酶是具有绝对专一性的酶。
若样品中存在除待测物质外其他可作为底物的物质时，可利用偶联酶的专一性进行区别定量分析。
2．反应的平衡对于终点法来说，要求反应接近进行完全，故对不同的酶反应须采取不同的措施使反应进行到接近完全。
若酶反应平衡十分偏向进行方向，则可方便的用终点法进行检测，不需进行任何处理。
若反应的平衡并不十分偏向进行方向，或偏向逆方向，那么由于反应不能完全，因而也就不能正常定量。
为了解决这一问题，通常采取以下一些措施：对于双底物反应尽可能提高第二底物的浓度对氧化还原之类与H＋有关的反应要选择适当的pH设法除去产物用具有不同平衡常数的辅酶类似物代替原有的辅酶和第二底物的再生系统偶联，则第一底物可能完全转化为反应产物3．反应液中的酶量对于一个具体的测定来说不同的酶反应有不同的Km值，通过米氏方程和均相溶液反应的动力学推算和分析，可以大致得到如下的结论：对于单酶反应的酶法分析：所加入的酶量（u/ml）相当于Km（mmol）对于偶联反应的酶法分析，所加入的酶量如下：第一反应为酶量（u/ml）相当于Km1（mmol）第二反应为酶量（u/ml）相当于（1～2）×Km2（mmol）4.反应产物抑制若产物对反应本身有抑制作用，则就会妨碍反应进行，在这种情况下可采取将该产物除去或者和再生系统偶联的办法解决。
第一章1.酶工程：是生物工程的重要组成部分，是随着酶学研究迅速发展，特别是酶的推广应用，使酶学和工程学相互渗透、结合、发展而成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。
2.化学酶工程：指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用3.生物酶工程：是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术结合的产物，亦称高级酶工程。
4.酶工程的组成部分？答：酶工程主要指自然酶和工程酶（经化学修饰、基因工程、蛋白质工程改造的酶）在国民经济各个领域中的应用。
内容包括：酶的产生；酶的分离纯化；酶的改造；生物反应器。
5.酶的结构特点？答：虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎所有的酶都是蛋白质，因而酶必然具有蛋白质四级结构形式。
其中一级结构是指具有一定氨基酸顺序的多肽链的共价骨架；二级结构为在一级结构中相近的氨基酸残基间由氢键的相互作用而形成的带有螺旋、折叠、转角、卷曲等细微结构；三级结构系在二级结构基础上进一步进行分子盘区以形成包括主侧链的专一性三维排列；四级结构是指低聚蛋白中各折叠多肽链在空间的专一性三维排列。
具有低聚蛋白结构的酶（寡聚酶）必须具有正确的四级结构才有活性。
具有活性的酶都是球蛋白，即被广泛折叠、结构紧密的多肽链，其氨基酸亲水基团在外表，而疏水基团向内。
6.酶活性中心：是酶结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子中相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。
7.酶作用机制有哪几种学说？答：锁和钥匙模型、诱导契合模型8.酶催化活力的影响因素？答：底物浓度、酶浓度、温度、pH等。
9.酶的分离纯化的初步分离纯化的步骤？答：（一）材料的选择和细胞抽提液的制备1.材料的选择：目的蛋白含量要高，而且容易获得2.细胞破碎方法及细胞抽提液的制备。
为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，应当使用类似于生理条件下的缓冲液。
动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪、切碎后放人捣碎机中。
酶工程期末重点总结一、酶工程概述酶工程是将酶应用于工业领域的一门科学，通过对酶的研究和改良，可以提高酶的稳定性、催化活力、选择性和产量，以满足工业生产的需求。
酶工程的应用范围广泛，涉及生物技术、医药化学、食品工程等多个领域。
二、酶的产生和分离纯化1. 酶的产生：酶可以通过天然微生物、重组DNA技术等方法进行生产。
天然微生物通过发酵过程产生酶，而重组DNA技术可以将特定基因导入到宿主微生物中，使其产生目标酶。
2. 酶的分离纯化：酶的分离纯化通常包括细胞破碎、组织液处理、沉淀和层析等步骤。
其中，层析是一种常用的分离纯化方法，包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
三、酶的性质和特点1. 酶的性质：酶是一种特殊的蛋白质，具有催化作用。
酶的催化作用是高度选择性的，可以加速化学反应的速率并降低反应的能量活化值。
2. 酶的特点：酶具有高效、低成本、环境友好等特点。
由于酶具有高度选择性，因此可以在温和的条件下催化反应，减少能耗和废弃物产生。
四、酶的改良和优化酶的改良和优化是酶工程的核心内容之一，旨在提高酶的催化活力、选择性和稳定性，以满足工业生产的需求。
1. 酶的改造：通过理性设计和随机突变等手段，改变酶的氨基酸序列，以改善其性质。
常用的改造方法包括点突变、插入突变和删除突变等。
2. 酶的固定化：将酶固定在材料表面或载体上，增加酶的稳定性和重复使用性。
常用的固定化方法包括包埋法、凝胶包覆法和共价固定法等。
3. 酶的进化：通过模拟自然界的进化过程，通过多代选择和酶库筛选等方法，获得具有改良性质的酶。
进化方法包括DNA重组技术、DNA重组酶库和聚合酶链式反应等。
五、酶工程在工业中的应用酶工程在工业中的应用广泛，涉及到生物能源、纺织印染、制药等多个领域。
1. 生物能源：酶可以催化生物质转化为生物能源，如酶解纤维素制备生物乙醇。
2. 纺织印染：酶可以代替传统的化学处理方法，实现更加环保和高效的染色和整理。
3. 制药：酶可以用于合成药物和研发新药，如利用酶合成青霉素等抗生素。
酶工程：酶的生产，改性与应用的技术过程。
酶的命名：氧化还原酶，转移酶，水解酶，裂和酶，异构酶，合成酶。
酶的生产方法：提取分离法，生物合成法，化学合成法。
胞外酶：大多数水解酶是微生物为了利用细胞外的大分子而释放到细胞外的酶。
胞内酶：合成后仍留在细胞内发挥作用的酶。
易受到中间产物和终产物的调控。
组成酶：细胞内一直存在的酶，它的合成仅受遗传物质控制。
诱导酶：在环境中有诱导物（底物）存在时，微生物因诱导物的存在而产生的酶。
酶活力：一定条件下，酶所催化的反应初速度。
酶的比活力：是酶纯度的一个标准，是指在特定条件下，单位质量（mg ）蛋白质或RNA 所具有的酶活力单位数。
酶的转换数：Kcat,又称摩尔催化活性，指每个酶分子每分钟催化底物转换的分子数。
酶的催化周期：酶的转换数的倒数。
指酶进行一次催化所需的时间。
催化基团接触残基 结合基团酶活性中心的组成 辅助残基结果残基非必须残基产酶微生物的基本要求：1、无致病性2、发酵周期短3、易于培养，营养要求低4、遗传稳定，不易变异退化5、产胞外酶更好常见产酶微生物：大肠杆菌、醋酸杆菌、枯草芽孢杆菌、根霉、曲霉操纵子包括哪些结构? 调节基因、启动子、操纵基因、结构基因酶合成的调节机制：1乳糖操纵 酶的诱导2 Trp 操纵 酶的阻遏（末端产物调控）衰减子调控 Trp-Trna3 分解代谢物阻遏培养基设计原则：1选择合适的培养物质2营养物浓度和配比3物理化学条件4 优化设计提高产酶的措施：1 添加诱导物2 控制阻遏物浓度 3 添加表面活性剂（增大细胞膜穿透性）4 添加产酶促进剂酶合成的模式1同步合成型 微生物生长便产生酶，进入生长期，酶大量产生，进入平衡期，酶生成停止。
2 中期合成型 大部分为诱导型酶3 延续合成型 （最理想模式）µ 比生长浓度 x 细胞浓度 Rx 细胞生长速率宏观产酶动力学：研究群体细胞的产酶速率及其影响因素。
微观产酶动力学：研究细胞中酶合成速率及其影响因素。
第一章绪论1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。
答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶有哪些显著的催化特性？答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（107~1013倍）；（3）酶催化作用条件温和。
3、简述影响酶催化作用的主要因素。
答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。
酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。
（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。
（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。
一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。
（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。
（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。
如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。
5、简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
答：概念：在特定条件下（温度可采用25°C，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位（IU）。
第一章绪论生体内成千上万个错综复杂的生化反应构成了新陈代谢的网络。
这些反应都是在生物催化剂—酶的作用下有条不紊、绵绵不断地进行着。
可以说生体酶的化学本质是蛋白质，同时又具有催化剂的功能。
几乎所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，没有酶的存在，也就没有生物体的生命活动。
人类在生产实践中很早就不自觉地利用了酶，酶的利用最初起源于酿酒、造酱、制饴等生产和生活实践（在我国早在夏禹时代，人们就会酿酒；而在“周礼”中已经有造酱、制饴的记载）。
当然，在古代人们对酶的存在及其所起的作用还缺乏甚至没有认识。
人类对酶的真正认识只有二三百年的历史，1684年比利时医生第一次把引起发酵过程中物质变化的因素称为酵素；后来，Liebig在研究酿酒工程中，首次认为发酵现象是由于酵母细胞中含有发酵酶，是发酵酶催化糖发酵产生了酒精；一般认为真正的酶学研究开始于Buechner的发现，他通过研磨酵母细胞、汲取细胞汁液用于糖发酵的实验，证实了：酶能够以溶解的、有活性的状态从破碎的细胞中分离出来，从而推动了酶的分离以及对酶的理化性质的探讨和研究，促进了对各种与生命活动有关的酶系统的研究。
历史上，对酶的化学本质的认识也经历了长期的过程，长期以来人们并不认为酶是蛋白质。
Willstatter认为酶不一定是蛋白质，他将过氧化物纯化了12000倍后，酶的活性很高，但检测不到蛋白质，所以他错误地认为酶是由活动中心与胶质载体组成的，活性中心决定酶的催化能力及专一性，胶质载体的作用在于保护活性中心，蛋白质只是保护胶质载体的物质，并以此来解释酶纯度越高越稳定的实验现象。
这一错误观点是由于当时对蛋白质检测水平的限制造成的，而且也与Willstatter当时的权威地位有关。
直到1926年Sumner第一个获得了脲酶的蛋白质结晶，才提出了酶是蛋白质的观点；后来，Northrop和Kunitz得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶等结晶酶，并证实了这些结晶都是纯蛋白质后，酶的蛋白质属性才被人们普遍接受。
酶工程学习总结及领悟这一学期我学习了《酶工程》,了解了各种酶的性质及其在食品工业中的特殊作用,揭开了酶学的本质,让我受益匪浅。
酶工程是将酶学理论与化工技术相结合,研究酶的生产和应用的一门新的技术性学科.包括酶制剂的制备,酶的固定化,酶的修饰与改造及酶反应器等方面内容.,酶分离纯化技术的更新,酶制剂的研究得到不断推进并实现了商业化生产,已开发出多种类型的酶制剂.由于天然酶制剂稳定性较差,使用效率低等特点,人们发展了酶的固定化技术在并在此基础上发展了多酶体系的固定化技术和细胞的固定化技术。
因为我的专业是食品科学与工程,所以我简单的说一下酶在食品工业中作用。
其最大的用途是淀粉加工，其次是乳品加工、果汁加工、酶工程烘烤食品及啤酒发酵。
与之有关的各种酶如淀粉酶、葡萄糖异构酶、乳糖酶、凝乳酶、蛋白酶等占酶制剂市场的一半以上。
目前，帮助和促进食物消化的酶成为食品市场发展的主要方向，包括促进蛋白质消化的酶（菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等），促进纤维素消化的酶（纤维素酶、聚糖酶等），促进乳糖消化的酶（乳糖酶）和促进脂肪消化的酶（脂肪酶、酯酶）等.《酶工程》这一本课程主要给我们从简单到复杂的介绍了酶这一物质,首先简单的讲述了酶工程的基础,接着通过酶的发酵工程(以微生物产酶为核心对象,介绍微生物产酶的代谢机制、发酵工艺和发酵动力学)引出了酶的分离工程(介绍酶的提取纯化系列单元操作方法原理),最后给我们介绍了酶的修饰改造。
其中重要的几种酶有生物化学酶,有固定化酶、化学酶、生物酶、非水相酶等。
食品在加工、运输和保藏过程中，因受到氧、微生物、温度、湿度、光线等因素的影响，使它的色、香味及营养发生变化，甚至导致变质降低食用价值。
因此，如何尽可能地保留食品原有的品质特性始终是食品加工、运输和贮存过程中的一个重要问题。
所以通过生物酶制剂的应用,可以解决这些问题。
比如酶制剂保鲜,酶制剂保鲜技术是利用酶的催化作用，防止或消除外界因素对食品的不良影响，从而保持食品原有的品质与特性的技术。
第一章酶学概论1.酶：具有生物催化功能的生物大分子。
2.酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程。
3.酶活力(enzyme activity)：指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。
4.酶活力单位(IU)：在特定条件下(温度可采用25℃，pH值等条件均采用最适条件），每1min催化1µmol的底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位，这个单位称为国际单位（IU）5.酶转换数Kp：又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。
即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的一个指标。
6.酶的催化周期：转换数的倒数，即催化周期是指酶进行一次催化所需的时间，单位为毫秒（ms）或微秒（µs）。
7.酶结合效率：又称为酶的固定化效率，是指酶与载体结合的百分率。
酶结合效率的计算一般由固定化的总活力减去未结合的酶活力所得到的差值，再除以用于固定化的总酶活力而得到。
8.酶活力回收率：指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。
9.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或酶RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。
10.核酸酶(ribozyme):具有催化活性的RNA。
抗体酶(Abzyme):具有催化活力的抗体。
11.组成型酶：有的酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速度影响不大，如DNA/RNA聚合酶。
12.适应型酶/调节性酶：有的酶在细胞内的含量变化很大，其合成速度明显受到环境因素的影响，如β-半乳糖苷酶13.模拟酶：又称人工合成酶或酶模型，是指根据酶的作用原理，用人工合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。
14.酶催化作用的特点：1.酶催化作用的专一性强(相对/绝对专一性) 2.酶催化作用的效率高3.酶催化作用的条件温和 4.酶活性受到调节和控制15.影响酶催化作用的因素：1.底物浓度的影响2.酶浓度的影响3.产物浓度的影响4.温度的影响5.pH值的影响6.抑制剂的影响7.激活剂的影响16.酶生物合成的调节：1、分解代谢物阻遏作用2、酶生物合成的诱导作用3、酶生物合成的反馈阻遏作用17. 从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。
1. 酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
2. 酶：是具有生物催化功能 生物大分子。
优点：具有专一性、催化效率高和作用条件温和等显著特点。
3. 酶的命名： ①氧化还原酶 AH 2+B=A+BH 2 EC 国际酶学委员会②转移酶 AB+C=A+BC ③水解酶 AB+H 2O=AOH+BH④裂合酶 AB=A+B⑤异构酶 A=B⑥合成酶/连接酶 A+B+A TP=AB+ADP+Pi4. 评价固定化酶的指标固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。
酶的结合效率：又称酶的固定化率，是指酶与载体结合的百分率。
%100-×≈加入的总酶活力未结合的酶活力加入的总酶活力酶结合效率未结合的酶活力，包括固定化后滤出固定化酶后的滤液以及洗涤固定化酶的洗涤液中所含的酶活力的总和。
酶活力回收率是指：固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。
%100×≈用于固定化的总酶活力固定化酶总活力酶活力回收率相对酶活力：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。
5. 酶活力:又称为酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。
通常以在一定条件下酶所催化的化学反应(初)速度来表示。
6. 酶活力单位U ：是衡量酶活力大小的计量单位,又称酶单位，规定条件（最适条件）下一定时间内催化完成一定化 学反应量所需的酶量。
①国际单位IU ：1961年，在最适条件下每分钟转化1μmol 底物所需要的酶量为一个酶活力单位。
即1IU= 1μmol/min ②国际单位Kat ：1972年，指在最适条件下1秒钟内转化1mol 底物所需的酶量。
即 1 Kat=1mol/sKat 和IU 的换算关系：1 Kat=6×107 IU7. 酶的比活力（比活性）：每单位（一般是mg ）蛋白质中的酶活力单位数（酶单位/mg 蛋白）。
8. 比酶活：9. 在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念： 纯化倍数与回收率纯化倍数=某纯化操作后的比活力/第一步操作后的比活力回收率=某纯化操作后的总活力/第一步操作后的总活力总活力＝单位体积的酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml)10. 提高酶产量的措施1、添加诱导物 诱导物一般可以分为3类原理：对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。
1 酶是具有生物催化功能的生物大分子, 按照其化学组成, 可以分为蛋白类酶(P 酶) 和核酸类酶( R 酶) 两大类别。
蛋白类酶主要由蛋白质组成, 核酸类酶主要由核糖核酸( R N A ) 组成。
2 酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。
酶工程的主要内容包括: 微生物细胞发酵产酶、动植物细胞培养产酶, 酶的提取与分离纯化, 酶分子修饰, 酶、细胞和原生质体固定化、酶的非水相催化、酶反应器和酶的应用。
酶工程的主要任务是经过预先设计, 通过人工操作, 获得人们所需的酶, 并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能的技术过程。
3 酶是生物催化剂, 与非酶催化剂相比, 具有专一性强, 催化效率高和作用条件温和等显著特点。
4 酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、p H 值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。
在酶的应用过程中, 必须控制好各种环境条件, 以充分发挥酶的催化功能。
5 根据国际酶学委员会的建议, 每一种具体的酶都有其推荐名和系统命名。
6 。
酶的推荐名一般由两部分组成: 第一部分为底物名称, 第二部分为催化反应的类型。
后面加一个“酶”字(-ase)。
不管酶催化的反应是正反应还是逆反应, 都用同一个名称。
例如, 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase), 表明该酶的作用底物是葡萄糖, 催化的反应类型属于氧化反应。
7 酶的系统命名则更详细、更准确地反映出该酶所催化的反应。
系统名称(syste m atic na m e) 包括了酶的作用底物、酶作用的基团及催化反应的类型。
8 酶活力是指在一定条件下, 酶所催化的反应初速度。
在外界条件相同的情况下, 反应速度越大, 意味着酶活力越高。
9 1961 年国际生物化学与分子生物学联合会规定: 在特定条件下(温度可采用25℃, p H 值等条件均采用最适条件), 每1 min 催化 1 μm ol 的底物转化为产物的酶量定义为1 个酶活力单位, 这个单位称为国际单位(I U )。
