病毒分离鉴定培训课件

病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离…（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。

1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。

所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。

细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。

原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。

原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。

因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。

二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。

二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。

二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃ ）内，做为“种子”，供以后传代用。

病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。

它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。

为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。

本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。

一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。

以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。

首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。

2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。

通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。

3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。

通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。

二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。

以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。

这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。

2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。

根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。

3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。

这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。

结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。

通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。

病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。

注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。

第一节病毒的分离与鉴定[授课学时]2学时[学习重点]标本的采集、运送及处理的方法和注意事项；病毒分离培养与鉴定的方法。

[基本概念]1．组织培养：将人或动物离体组织块或分散的活细胞，模拟体内的生理条件在试管或培养瓶内加以培养，使之生存和生长，称为组织培养。

目前一般所指的组织培养多指单层细胞培养。

2．原代细胞培养：采用机械或胰蛋白酶等处理离体的新鲜组织器官，制成分散的单个细胞悬液，加入生长液后，分装于培养管中培养，活细胞贴壁生长繁殖，数天后形成单层细胞，称原代细胞培养。

3．次代细胞培养：将原代细胞培养物轻微消化后，再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培养，即为次代培养。

4．二倍体细胞株：原代细胞经过多次传代仍能保持二倍体特性，称为二倍体细胞株。

5．传代细胞系：来源于肿瘤细胞或细胞株在传代过程中变异的细胞系，是能在体外无限传代的细胞系。

6．细胞病变效应（CPE）：病毒在细胞内增殖后，由病毒引起的细胞形态学改变，称为细胞病变效应。

[基本要点]注意学习以下内容：1．病毒检验的大致程序：临床标本→分离培养→初步鉴定→最后鉴定。

2．标本的采集运送及处理：发病初期从感染部位采集足量标本，低温运送、保存，尽快送检，分离培养前去除标本中的沉渣、细菌、真菌和毒性物质等，必要时需浓缩、提纯。

3．病毒分离培养方法：包括组织培养、鸡胚接种、动物接种。

4．根据细胞的来源、染色体特性及传代次数，细胞培养可分为三种类型：原代和次代细胞培养、二倍体细胞株、传代细胞系。

其中传代细胞系的增殖特性类似于恶性肿瘤细胞，可选择性地用于病毒的分离、鉴定等研究。

5．鸡胚接种常用于粘液病毒、疱疹病毒、痘类病毒等的原代培养，也可选择性地用于疫苗生产。

根据病毒种类的不同，接种病毒的部位也各异，包括鸡胚尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种和绒毛尿囊膜接种。

6．动物接种分离病毒需要选择敏感动物及合适的接种部位。

7．病毒的初步鉴定依据：动物感染范围及潜伏期、对鸡胚的敏感性、细胞形态变化类型、红细胞吸附、病毒干扰现象、血凝性质、理化性质（核酸类型测定、大小形态、乙醚敏感试验、耐酸试验）8．病毒的最后鉴定依据：主要是血清学方法（中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验）和分子生物学方法。

病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。

1. 病毒的分离1.1 标本的处理1.1.1 标本的收集a）粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000X g, 4C离心6min 。

b）拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml 运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000X g 4C离心30min。

c）组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液，3000X g 4C离心30min。

1.1.2 除菌处理a）粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4C过夜。

b）鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4C作用4小时c）对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4 C过夜除菌。

1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。

根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。

1.2.1鸡胚接种a）鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致b）孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行，气室向上，孵育的最适温度为38--39C，相对湿度为40—70%，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。

c）检卵：鸡卵孵育4〜5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。

①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。

②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。

③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。

附件1 病毒分离鉴定采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种灵敏方法。

通常使用对猪瘟病毒敏感的细胞系如PK-15细胞等加入2扁桃体、肾脏、脾脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。

37℃培养4872小时后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的猪瘟病毒。

步骤如下1. 制备抗生素浓缩液青霉素10000IU/mL、链霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL小瓶分装-20℃保存。

用时融化。

2. 取12g待检病料组织放入灭菌研钵中剪刀剪碎加入少量无菌生理盐水将其研磨匀浆再加入Hank’S平衡盐溶液或细胞培养液制成20w/v组织悬液最后按1/10的比例加入抗生素浓缩液混匀后室温作用1小时以1000g离心15分钟取上清液备用。

3. 用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层将所得细胞悬液以1000g离心10分钟再用一定量EMEM生长液含5胎牛血清无BVDV抗体56℃灭活30分钟、0.3谷氨酰胺、青霉素100I U/mL、链霉素100I U/mL悬浮使细胞浓度为2×106/mL。

4. 9份细胞悬液与1份上清液混合接种68支含细胞玻片的莱顿氏管leighton’s或其它适宜的细胞培养瓶每管0.2mL同时设3支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照另设3支莱顿氏管接种猪瘟病毒作阳性对照。

5. 经培养24、48、72小时分别取2管组织上清培养物及1管阴性对照培养物、1管阳性对照培养物取出细胞玻片以磷酸缓冲盐水PBS液pH7.20.01M或生理盐水洗涤2次每次5分钟用冷丙酮分析纯固定10分钟晾干采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进行检测见附件2。

6. 根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度判定病毒在细胞中的增殖情况若荧光较弱或为阴性应按步骤4将组织上清细胞培养物进行病毒盲传。

临床发病猪或疑似病猪的全血样是猪瘟早期诊断样品。

接种细胞时操作程序如下取-20℃冻存全血样品臵37℃水浴融化向24孔板每孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PK-15单层细胞37℃吸附2小时。

病毒的分离与鉴定病毒是一类微小的病原体，其特点是不能自主繁殖，必须寄生在宿主细胞内才能完成复制过程。

为了有效地控制和治疗病毒引起的疾病，研究人员需要对病毒进行分离和鉴定。

本文将介绍病毒的分离与鉴定的方法和步骤。

一、病毒的分离方法1. 细胞培养法：病毒通常寄生于宿主细胞内，通过培养宿主细胞，可以将病毒从样本中分离出来。

这种方法适用于许多病毒，如流感病毒、乙肝病毒等。

2. 动物接种法：某些病毒只能在特定宿主动物中复制，通过向实验动物接种疾病样本，可以使病毒复制并分离出来。

例如，用小鼠进行实验可以分离出小鼠肝炎病毒等。

3. 组织切片法：对于某些病毒，它们会引起组织的明显病变，此时可以取得感染组织的切片进行病毒分离。

例如，用患病动物的脑组织切片进行病毒分离，可用于研究狂犬病病毒等。

二、病毒的鉴定方法1. 电镜观察法：电子显微镜（TEM）可以观察到病毒的形态和结构特征，通过观察病毒的颗粒形状、大小、壳结构等特征，可以初步确定病毒的种类。

2. 免疫学方法：根据病毒与宿主细胞之间的免疫反应，可以采用免疫学方法进行病毒鉴定。

包括免疫荧光法、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，可以检测病毒的抗原或抗体存在。

3. 分子生物学方法：利用PCR（聚合酶链式反应）技术、序列分析等分子生物学方法，可以对病毒的基因组进行检测和鉴定。

这些方法对于那些无法用传统手段鉴定的病毒，如新型冠状病毒等，具有重要意义。

4. 勒芒氏法：这是一种用于病毒核酸的立体构建鉴定方法。

勒芒氏法根据病毒核酸在Denhardt液中染色的不同程度进行鉴定。

在进行病毒的分离与鉴定时，研究人员需要注意采取适当的实验室安全措施，避免交叉感染和意外暴露。

此外，病毒的分离与鉴定是一个复杂的科研过程，需要综合运用各种实验技术和方法，推动疾病防控工作的进展。

总结起来，病毒的分离与鉴定是关键的实验工作，它们为了研究病毒的性质、传播途径以及寻找有效的防治策略提供了基础性的支持。