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一株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定方超，张智明，李建华，何世岷（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨150069）摘要：为了给猪流感疫苗的研制做准备，试验将从某猪场现地采集疑似猪流感发病猪的鼻拭子样品，经过处理后接种至10~11日龄SPF 鸡胚进行盲传，分离到1株具有血凝性的病毒。
通过血清学、分子生物学鉴定、电镜观察、动物回归试验等方法对该病毒进行鉴定。
结果发现：该病毒可与猪流感病毒H3亚型阳性血清特异性结合；通过分子生物学检测，该分离株出现猪流感病毒H3亚型和N2亚型目的片段；将该分离株液置于电镜下观察可见直径为80~120nm 且具有囊膜和纤突的病毒粒子，符合猪流感病毒粒子形态特征；用纯化后的病毒攻击4~6周龄阴性仔猪，攻毒组仔猪发病率可达80%。
由此可见分离获得的病毒为H3N2亚型猪流感病毒。
关键词：猪流感；H3N2亚型；分离鉴定；病毒纯化中图分类号：S852.4文献标志码：A文章编号：1001-0084（2021）03-0015-05Isolation and Identification of a H3N2Subtype Swine Influenza VirusFANG Chao,ZHANG Zhiming,LI Jianhua,HE Shimin(Harbin Pharmaceutical Group Bio-vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China)Abstract:In order to prepare for the development of swine influenza vaccine,nasal swab samples from pigs suspected of having swine influenza were collected at a pig farm.After treatment,10-11-day-old SPF chicken embryos were inoculated for blind transmission,and a strain of hemagglutinating virus was isolated.The virus was identified by serology,molecular biological identification,electron microscope observation and animal regression test.The results showed that:the virus could specifically bind to the H3subtype positive serum.Molecular biological detection demonstrated that H3subtype and N2subtype target fragments appeared in the isolated strains.The virus particles 80-120nm in diameter with capsule membrane and fibrillae were observed from the isolated strains liquid under the electron microscope,which is consistent with the morphological characteristics of swine influenza virus particles.When the purified virus was used to attack the negative piglets aged from four to six weeks,the morbidity of piglets in the challenge group could reach 80%.Thus,the isolated virus was H3N2subtype swine influenza virus.Key words:swine influenza;H3N2subtype;isolation and identification;virus purification 收稿日期：2021-01-15作者简介：方超（1988—），女，山东诸城人，兽医师，硕士，研究方向为预防兽医学，****************。
某区甲型H1N1流感病毒分离鉴定及同源性的分析曹晓;巩飚;胡淮洁;许娇;冉冉【摘要】Objective Detection and separation of H1N1 influenza virus, the first area of Kaifeng virus strains were isolated from whole genome sequencing and homology analysis, to provide a scientific basis for the study of influenza virus epidemic and the variation law.Methods Real-time RT-PCR method for detection, screening to determine the influenza AH1N1 virus positive specimens; using MDCK cells isolated H1N1 influenza virus strain A/Kaifeng/01/2009 (H1N1); measured and analyzed their whole genome sequence; conducted using sequence alignment homology analysis.Results H1N1 influenza virus were detected in samples from 1828 were positive for influenza-like illness in 286 copies, the positive rate of 15.6%. The first time the whole strain of H1N1 influenza virus genome sequence and in Kaifeng area. Genome sequence analysis showed that: the strain and 2009 pandemic strain is highly homologous to the same evolutionary branch. Previous epidemic of swine influenza virus strains found in contrast, HA gene 12 bp point mutation occurred. Conclusion MDCK cells (H1N1) virus has a high sensitivity; Kaifeng area first case ofH1N1 flu virus strains isolated in North America epidemic strains highly homologous; compared with the previous representative strains of classical swine influenza HA protein antigen appeared drift; lay the foundation for further research in molecular biology (H1N1) virus in the future.%目的：检测并分离甲型H1N1流感病毒，对开封地区首次分离到的病毒株进行全基因组序列测定及同源性分析，为研究流感病毒的流行及变异规律提供科学依据。
H3N2亚型犬流感病毒的分离鉴定佘利旋;熊永忠;远立国;袁天梅;贾坤;李守军【摘要】To evaluate the prevalence of canine influenza virus (CIV) in Guangzhou area, samples of 107 nasopharynx swabs and 58 serum were collected from dogs for virus isolation and antibody detection. Three H3N2 subtype CIV were isolated. The 50％ embryo infectious dose (EID50) of the three isolates were 10-2.42/0.1 mL to 10-3.5/0.1 mL respectively. The mean death time (MDT) ranged from 177,6 h to 192 h. All three isolates were sensitive to ether, chloroform acidum and heat, and the isolates possessed HA activity to erythrocytes of rooster, guineapigs, pig and cattle.%为了解广州地区犬流感的流行情况,本研究采集107份犬鼻咽拭子样品和58份血清样品,SPF鸡胚分离病毒并进行抗体检测.结果显示:分离获得3株H3N2亚型犬流感病毒.分离株的EID50为10-2,42/0.1 mL～10-3.5/0.1 mL;MDT为177.6 h～192 h;对乙醚、氯仿、酸和温度均敏感;对血凝素为热不稳定型;能够凝集公鸡、豚鼠、猪和牛的红细胞.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)001【总页数】4页(P15-18)【关键词】犬流感病毒;H3N2亚型;分离鉴定;生物学特性【作者】佘利旋;熊永忠;远立国;袁天梅;贾坤;李守军【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,维科生物技术开发公司,黑龙江,哈尔滨,150069;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;海珠区爱宠动物诊疗所,广东,广州,510220;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S852.65犬流感(Canine influenza，CI)是由正粘病毒科流感病毒属A型CI病毒(CIV)引起的犬呼吸道传染病。
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）是一种影响犬科动物的呼吸道疾病，最初在2004年首次在美国佛罗里达州引起了大规模的流行。
犬流感病毒是一种单股正链RNA 病毒，属于流感病毒科。
近年来，犬流感病毒引起了广泛的关注，其对犬的健康和生产力造成了严重的影响。
本文旨在介绍犬流感病毒的分离鉴定方法以及对其部分基因序列的分析。
一、犬流感病毒的分离鉴定1. 样品收集与处理需要对可能感染犬流感病毒的样品进行收集。
常见的样品包括犬鼻拭子、犬气管、犬肺组织等呼吸道相关的样品。
收集后，需立即将样品置于离心管中，并添加适量的细菌保存液或生理盐水，迅速送至实验室进行分离处理。
2. 病毒分离常用的病毒分离方法包括细胞培养法、鸡胚培养法等。
在病毒分离过程中，需要使用对犬流感病毒具有敏感性的细胞株，例如MDCK细胞株。
将样品接种于细胞培养基质中并培养一定时间，观察细胞情况，如发现病毒感染，可进一步进行鉴定。
3. 病毒鉴定在病毒分离后，需对分离的病毒进行鉴定。
目前常用的鉴定方法包括免疫荧光检测、PCR扩增等。
通过对病毒的免疫学特性和基因组结构进行分析，可以准确鉴定犬流感病毒，并进一步进行部分基因序列分析。
二、犬流感病毒部分基因序列分析1. 基因提取与扩增通过PCR扩增技术，可以对犬流感病毒的部分基因进行提取和扩增。
常用的基因包括HA（血凝素）、NA（神经氨酸酶）等。
通过PCR扩增后，可以得到病毒基因的DNA序列，为后续分析提供基础数据。
2. 基因测序将PCR扩增后的基因片段进行测序分析，可以得到该基因片段的具体序列信息。
通过比对数据库中已有的犬流感病毒基因序列，可以快速准确地确认所得基因序列的相关性，为病毒的分子鉴定提供重要依据。
对犬流感病毒基因序列进行分析，可以了解其遗传多样性、变异情况等重要信息。
通过比对分析，可以揭示不同病毒株之间的遗传关系、演化轨迹等。
基因序列分析还可以为疫苗研发、药物设计等提供重要参考。
流感病毒的分离技术操作规范病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK 细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（一）实验室生物安全级别和生物安全规定1. 流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2. 流感病毒分离实验室生物安全规定应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）1. 试验材料（1）刚75-90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）（SIGMA T8802）（3）HEPES缓冲液,1M母液（4）D-MEM培养基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's 液（5）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸链霉素)（6）牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15260）（7）处理好的临床标本0.5mL（标本处理参见附件1第一部分）（8）无菌移液管：1mL和10mL2. 培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）（1）500mLD-MEM液中加入：a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达：100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素)b) 牛血清白蛋白组分V12.5mL(终浓度:0.25％)c) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)（2）病毒生长液：再向上述培养液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的浓度为2µg/mL。
