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流感病毒的收集与纯化标准操作规程（编号：054）1、目的及适用范围该SOP用来规范流感病毒的收集和纯化标准操作。
2、主要仪器试剂超净工作台、冷冻立式超速离心机（BeckmanXL90）、冷冻台式高速离心机、天平、超速离心管、50mL离心管、0.01 mol/L PBS pH7.4、30%、40%、50%、60%蔗糖3、操作步骤3.1将病毒接种于SPF鸡胚，48 h收集尿囊液以5000 rpm（#3334）离心30 min，取上清液；或者将病毒接种于细胞，待细胞基本病变收取上清。
12000rpm（#3332），离心15min，去上清。
3.2 将上清液以100000g（Ti40）离心2 h，将沉淀物用1 mL 0.01 mol/L PBS pH7.4悬浮，振荡均匀；3.3 加至依次由30%、40%、50%、60%蔗糖制成的密度梯度上，以100000g（SW40）离心2h，取沉淀条带；3.4 取沉淀条带加10倍量PBS悬浮、振匀，再次以100000g （Ti80）离心2 h，取沉淀用200μL 0.01 mol/L PBS pH7.4或20 mM Hepes/20mM Mes/130mM NaCl, pH7.5悬浮、振匀，-80℃保存。
4、注意事项4.1 注意对称平衡。
使用天平，进行配平，保证离心对称平衡。
4.2 如离心管盖子密封性差液体就不能加满（针对高速离心且使用角度头），以防外溢。
外溢后果污染转头和离心腔，并失去平衡，影响感应器正常工作。
最高液面查离心机相应说明书。
4.3 SW40超速离心时，液体一定要加满离心管，只余留2mm空间，超离时需抽真空，只有加满才能避免离心管变形。
4.4 使用角度头时别忘盖转头盖，如未盖，离心腔内会产生很大的涡流阻力和摩擦升温，这等于给离心机的电机和制冷机增加了额外负担，影响离心机的使用寿命。
113。
一、目的确保疑似禽流感病例标本得到有效的检测，为禽流感病毒感染提供可靠的实验室诊断依据。
国家流感中心实验室按照规定方法对疑似禽流感感染病例的标本进行处理和检测，使疑似禽流感病例标本的处理和检测得到有效的控制。
保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。
二、范围适用于中国国家流感中心所有技术人员进行疑似禽流感病例标本的检测。
三、背景本SOP 是为配合疑似H5N1禽流感感染病例的诊断而制定，确保禽流感病例诊断的快速性和可靠性，同时要求实验操作过程中标本不被污染或污染环境。
四、程序（一）生物安全要求分装标本、裂解病毒需在BSL-3级实验室操作；核酸提取可在BSL-2级实验室生物安全柜内操作；PCR 反应体系配制在体系配制区；PCR 产物检测在电泳区操作。
要遵守相应生物安全规定（见“生物安全个人防护SOP ”）。
（二）材料及仪器1．提RNA Kit ：QIAGEN RNeasy Mini Kit （catalog #74104）2．β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）3．70％乙醇4．RT-PCR Kit ：QIAGEN One step RT-PCR Kit （catalog #210212）5．Promega RNasin Ribonuclease Inhibitor （catalog #N2111）6．检测引物：Forword and Reverse Primers （均为10μM ），序列如下：标准操作规程（SOP ）——PCR 检测类型序列甲型通用FluA-M-F173FluA-M-R3825’-GAC CAA TCC TGT CAC CTC TGA C-3’5’-AGC TGA GTG CGA CCT CCT TAG-3’H5 H5HA-F920H5HA-R11385’-GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC-3’5’-CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG-3’N1 AN1-F550AN1-R11645’-TTG CTT GGT CAG CAA GTG C-3’5’-CAG TCA CAC CAT TTG GA TCC-3’H7 H7HA-F245H7HA-R4285’-CCC AAT GTG AYC AAT TCC T-3’5’-GCT CCA TTR GTT CTT ATT CC-3’N7 N7-F1126N7-R14075’-ATG YTG AAR ATA CCT AAT GC-3’5’-GTA TTN GAT YTG TGC CCC ATC-3’H9 H9HA-F426H9HA-R8085’-GAA TCC AGA TCT TTC CAG AC-3’5’-CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG-3’N2AN2-F1121AN2-R14015’-CGC TAC GGT TAT GAG ACT TTC AG-3’5’-ATA TTC GCC CCA TCA GGC CAT GAG-3’ 7．Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C8．Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C9．Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头10．BIOHIT 10μL，100μL，200μL，1000μL加样器11．可调转速14K离心机：Eppendorf 5417R12．旋涡混合器：QL-901（国产）13．生物安全柜：LABCONCO（CLASS11）14．PCR仪：Biometra15．琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 10168516．核酸染料：Gold View，北京赛百盛基因技术有限公司，cat# HGV－1。
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
流感病毒的分离技术操作规范病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK 细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（一）实验室生物安全级别和生物安全规定1. 流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2. 流感病毒分离实验室生物安全规定应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）1. 试验材料（1）刚75-90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）（SIGMA T8802）（3）HEPES缓冲液,1M母液（4）D-MEM培养基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's 液（5）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸链霉素)（6）牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15260）（7）处理好的临床标本0.5mL（标本处理参见附件1第一部分）（8）无菌移液管：1mL和10mL2. 培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）（1）500mLD-MEM液中加入：a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达：100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素)b) 牛血清白蛋白组分V12.5mL(终浓度:0.25％)c) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（终浓度：2-3%)（2）病毒生长液：再向上述培养液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的浓度为2µg/mL。
一、目的急性期（<7d ）或恢复期（病后2～4周）血清抗体效价测定是流感诊断的主要方法之一，血清标本也可用于病毒核酸PCR 及病毒分离。
为保证样品质量、不被污染、采样过程安全及保护环境，中国国家流感中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的规程进行操作。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行血清标本的采集及储存。
三、程序（一）生物安全要求采集禽流感疑似病例急性期血清时，应以BSL-3级标准进行防护，可在BSL-2实验室分离。
采集禽流感疑似病例密接病例血清，按BSL-2级防护。
详见生物安全个人防护SOP 。
（二）材料1．BD 负压取血管 Ref.367955 5mL2．BD 采血配件 Ref.367237 成人或大于等于7岁儿童3．BD 采血配件 Ref.367238 用于小于7岁儿童4．2%碘酒，75%酒精，无菌棉签，压脉带（三）实验步骤1．采样（1）被采集对象如是急性期禽流感医学观察病例、确诊病例或疑似病例，应以BSL-3级标准进行防护，穿戴防护用品顺序：戴帽子-穿一次性医用手术衣-穿防护服-戴口罩-戴上防护眼镜-穿上鞋套、或胶鞋-戴上手套,将手套套在防护服袖口外面，进入病例所处核心污染区。
采集禽流感疑似病例密接病例血清，按BSL-2级防护，穿戴防护用品顺序：戴帽子-穿一标准操作规程（SOP ）储存次性医用手术衣-戴口罩-戴上防护眼镜-穿上鞋套或胶鞋-戴上手套,将手套套在防护服袖口外面，选择干净相对无菌条件下操作。
（2）标记采血管，包括被采集对象编号、姓名、性别、年龄，准备适当规格的采血配件及负压取血管。
务必仔细核对并记录。
（3）根据被采集对象具体情况，可选择肘前静脉、手背静脉或颈静脉（常用于小于3岁儿童）。
在扎上止血带后，拍打注射部位3－4次，还可用大拇指按压静脉2－3次，一般静脉受刺激后血管扩张血液充盈即可明显暴露，如果暴露还是不明显，可用右手食指沿解剖部位触摸，静脉的感觉柔软且富有弹性，并呈条索状。
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
必要时可以摇动或吹打来分离细胞。
然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。
2.3.7 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。
2.3.8 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）。
2.3.9 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。
通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。
2.3.10 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
3. 流感病毒细胞分离程序3.1 生物安全要求流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-2。
实验操作人员需进行BSL-2防护。
流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。
3.2 材料3.2.1 75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离3.2.2 胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）3.2.3 HEPES缓冲液，1M母液3.2.4 D-MEM培养基，Hank's液3.2.5 青、链霉素母液（10000 U/mL 青霉素G；10000 μg/mL硫酸链霉素）3.2.6 牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液3.2.7 临床样品0.5mL3.2.8 1mL无菌移液管3.2.9 10mL无菌移液管3.2.10 15mL无菌离心管3.3 实验步骤3.3.1 细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL 青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
3.3.2 病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2μg/mL。
3.3.3 流感病毒MDCK细胞分离步骤：3.3.3.1 75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。
a）用40×物镜观察细胞生长状态。
b）轻轻倒出细胞生长液，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
a）用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。
b）用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。
c）然后放于35℃5% CO2培养箱中吸附1～2h。
d）吸出接种物，用10 mL 的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。
然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。
e）放置于33～35℃培养箱培养。
f）每日观察细胞病变情况。
（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。
3.3.3.3 细胞培养物的收获当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。
即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。
收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10 mL 的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。
收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。
4. 流感病毒的鉴定至今对流感病毒鉴定最常用的方法为红细胞凝集抑制（HI）测定，因该法简便、易行、结果可信。
HI试验分常量法和微量法两种。
微量HI法是目前国际普遍使用的方法，也是WHO流感监测中推荐使用的标准方法。
HI试验的原理是流感病毒表面具有的血凝素蛋白能和含有唾液酸的受体物质特异结合，红血球浆膜上含有这类物质，当一定量病毒和适当比例的红血球混合后发生凝集，此为血凝现象。
而用流感病毒特异性抗体和病毒作用，干扰了病毒和红血球的结合从而抑制了血凝，此为血凝抑制现象。
这就是传统流感病毒的鉴定的理论依据。
微量HI法实验步骤如下：4.1 生物安全要求流感病毒的鉴定实验室生物安全级别：BSL-2。
实验操作人员需进行BSL-2防护。
流感病毒的鉴定操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。
4.2 实验材料4.2.1 分离培养物（标本）4.2.2 标准血清：常规鉴定用，包括甲1、甲3和乙型流感代表株的至少3种抗体；4.2.3 红血球：0.75%人“O”型红细胞4.2.4 受体破坏酶（RDE）4.2.5 PBS或生理盐水4.2.6 96孔微量板4.2.7 可调多通道移液器和单通道移液器及滴头4.2.8 其他水浴箱等4.3 HI试验操作过程4.3.1 加PBS或生理盐水25ul于96孔板的第B行至H行的每一孔。
4.3.2 加1：10稀释的经受体破坏酶处理过的标准血清50ul于A行的每一孔。
4.3.3 用多通道移液器从A行各孔取25ul血清，倍比稀释至H排各孔，弃去25ul。
4.3.4 25ul被检病毒的4个血凝单位抗原加至各孔，混匀，室温静置15-30min，4.3.5 然后加50ul的红血球（0.5%鸡红细胞或0.75%豚鼠红细胞），4.3.6 室温静置30-60min（鸡血球30min；豚鼠血球60min）后观察结果。
4.3.7 结果判定：血凝被完全抑制的血清最大稀释度的倒数为血凝抑制试验的终点，该孔稀释度即为HI试验的效价。
4.4 受体破坏酶处理血清目的是去除非特异性血凝抑制素。
因为人和动物血清中存在非特异性血凝抑制素，它们是游离在血清中类似病毒受体的唾液酸残基，能与病毒血凝素分子上的受体结合，会竞争抑制病毒与红血球的结合，因而造成假阳性，因此HI试验必须用受体破坏酶处理血清。
具体操作如下：4.4.1 3体积的RDE，1体积的血清（0.3ml RDE ：0.1ml血清）混合。
4.4.2 37℃水浴过夜。
4.4.3 56℃30min失活。
4.4.4 加入6体积的PBS或生理盐水混合，使血清稀释为1：10备用。
或者按4：1处理后，倍比稀释为1：10备用。
4.5 去除非特异性凝集素处理过的血清可能与红细胞发生非特异性凝集。
如血清中存在非特异性凝集，按下述方法处理：4.5.1 用1体积的红细胞和20体积的RDE处理过的血清充分混匀。
4.5.2 搁置4℃1小时，其间使沉降红细胞再悬浮、混匀。
4.5.3 900 X g 5min离心。
4.5.4 取上清，反复上述操作直至血清与红细胞的吸附阴性为止。
4.6 4个血凝单位抗原的调制病毒培养阳性的标本首先确定其HA滴度，在此基础上调制4个血凝单位抗原，用于HI 试验。
HA测定和4个血凝单位抗原的调制方法如下：4.6.1 HA测定a）50ul的PBS或盐水加入96孔微量板A-H行的2-12孔。
b）被检病毒各50ul分别加入A-H行的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去50ul，12孔为阴性对照。
c）加50ul的红细胞于每一孔，注意从低浓度至高浓度加入。
d）混匀、室温静止30min（鸡血）或60min（豚鼠血）。
e）确定HA滴度：完全血凝的最高稀释度的倒数为血凝滴度。
完全凝集为+，不完全凝集+/-，无凝集为-。
4.6.2 4个血凝单位的调制和再确认（复核）4.6.2.1 调制4个血凝单位1个血凝单位指能引起等量红细胞凝集的病毒量。
HI滴度是基于此测定的。
试验中需调制4个血凝单位，首先根据HA滴度，用8除其商为8个血凝单位的稀释度。
如某待检病毒的HA滴度为160，除8等于20。
即1：20（某标准参比抗原病毒0.1ml 加 1.9ml PBS）稀释病毒即得到8个血凝单位。
注意HI试验所需4个血凝单位指25ul病毒含4个血凝单位，而第二步确定所稀释病毒是否为4个血凝单位的HA试验用50ul体系，所以先调制为8个血凝单位。
确认4个血凝单位试验的具体操作如下：a）50ul的PBS或盐水加入96孔板的第2-12孔。
b）调制的8个血凝单位抗原100ul加入第一孔，然后倍比稀释至第6孔弃去50ul。
c）各孔加红血球50ul混匀，视血球的不同静置30-60min观察结果。
4.6.2.2 结果判定：若第1、2、3、4孔完全凝集，第5孔不凝集，表明该稀释病毒准确，可用于HAI试验。
如果第5孔也完全凝集说明该50ul病毒含16个血凝单位，需等量稀释病毒，如果只有前3孔凝集，说明该50ul病毒含4个血凝单位，病毒量需加倍。
另外，注意4个血凝单位须每次用前新鲜配制。
4.7 HI试验鉴定未知病毒时注意事项4.7.1 正确选用96孔微量板，根据所用红血球不同来决定，鸡血球选用V型板，豚鼠、人血球用U型板。
4.7.2 红血球的浓度和4个血凝单位的正确调制。
