介绍几种新的水中细菌总数检测方法

实验五水中细菌总数的检测一、实验目的1.采用标准平皿法对水样中细菌作计数。

2.掌握微生物实验中无菌操作技术方法。

二、实验原理水中细菌总数往往同水体受有机物污染的程度呈正相关，它是评价水质污染程度的一个重要指标之一。

由于重金属及某些其他有毒物质对细菌有杀灭或抑制作用，因此总细菌数少的水样，并不能排除已被这些物质所污染。

试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是一种测定水中好氧的和兼性厌氧的异养细菌密度的方法，由于细菌在水体中能以单独个体、成对、链状，成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或某一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。

细菌总数是指l ml水样在营养琼脂培养基中，37ºC、24h 培养后所生长的菌落数。

一般规定，1ml自来水中总菌数不得超过100个。

三、材料和器皿1.培养基：营养琼脂培养基牛肉膏：3-5 g ；NaCl ：5 g ；蛋白胨：10 g ；琼脂：15-20 g；H2O ：1000 ml ；pH ：7.0-7.2.2.无菌采样瓶、灭菌移液管、灭菌培养皿，盛有90ml及9ml灭菌蒸馏水的锥形瓶和试管。

四、方法和步骤1.采集水样。

2.吸取10ml水样(河水、污水、游泳池水或港湾水等)，注入罐有90ml无菌水的三角瓶中，混匀成10-1稀释液，在吸水样前，水样应彻底搅动均匀。

3.按10倍稀释法将水样稀释成10-2、10-3、l0-4。

4.营养琼脂培养基(用于河水样)倒平皿(厚度约2-3毫米，12毫升）水平放置至固化。

5.根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、l0-4稀释度；中等的选取10-1、10-2、10-3稀释度，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿0.2 ml，用玻璃刮刀涂匀。

稀释度的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30～300个之间。

6.将培养皿倒置于37ºC 培养24h，可观察出明显菌落。

（2）待检水样的采集方法
可应用采样器，器内的采样瓶应先灭菌。采水样
时，直接将水灌入已灭菌的采样瓶，不需再用样
水洗采样瓶。采样后，采样瓶内的水面与瓶塞底
部间应留有一些空隙，以便在检验时可充分摇动
混匀水样。
2. 水中细菌总数的测定
（1）水样的稀释（梯度稀释法） 根据水被污染程度的不同，可用无菌吸管作10倍 系列稀释。具体步骤如下：取水样10ml，盛于 有90ml无菌水的三角瓶内，充分振摇15分钟， 此即为10-1浓度的稀释液。静置15秒后，用无菌 吸管取10-1稀释液2 ml加至18ml无菌水试管中， 充分摇匀，此即为10-2浓度稀释液。另取无菌吸 管，依次作10倍知释，制成10-3、10-4……等一 系列稀释液，通常稀释至10-6浓度。
实验三、水中细菌总数的测定
（平板混匀法）
我国饮用水标准
细菌总数主要作为判断被检水样污染程度的标志。在水
质卫生学检验中，细菌总数是指1ml水样在牛肉膏蛋白
胨琼脂培养基中，于37℃经24小时培养后，所生长的细
菌菌落的总数。我国生活饮用水卫生标准（GB5749-
2006）中规定生活饮用水的细菌总数l ml中不得超过
微量移液器的使用方法

吸液时到第一格； 吸液时轻放； 排液时到第二格； 排液时快推。
（3）培养
待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于
37℃恒温箱内培养24小时，进行菌落计数，即
为l ml水中的细菌总数。
（4）菌落计数
先计算同一稀释度的平均菌落数，若其中一个平 皿有较大片状菌落生长时，则不予采用，而应以 无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落 数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中 菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2 以代表全皿菌落数，然后再计算该稀释度的平均 菌落数。

水中细菌总数的测定在正确制备培养基的基础上，能正确运用平板接种法正确举行细菌总数的测定；把握饮用水、水源水的细菌总数测定办法、步骤和要点。

一、养分琼脂培养基(供细菌总数的测定) 称取：蛋白陈2.5g，牛肉膏0.75g, NaCl1.25g于500ml烧杯中，加150ml蒸馏水溶解，另称取琼脂5g加100ml蒸馏水溶解，待所有溶解后，混匀，加10％ NaOH，调pH =7.4～7.6，熟化1h，除垢，用棉花过滤，分装，在121℃条件下，灭菌20min，备用。

二、仪器 1．高压蒸汽灭菌器。

2．干热灭菌(烘箱)。

3．水浴隔热培养箱。

4．冰箱。

5.培养皿(直径9ml)。

6．吸管(10.0ml、1.0m1)。

三、菌落计数原则 1．一个平皿有较大片菌落生长时，不宜采纳； 2．无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数； 3．成片状菌落不到平皿的一半，其余一半的菌落数分布匀称，则将半皿计数×2报告之。

四、注重事项 1．检验中所用玻璃器皿应洗净后采纳干热灭菌法(160℃，2h)举行灭菌； 2．培养基的pH值调整要正确； 3．培养基配制和储存是以2周为限； 4．培养基不宜反复多次灭菌，防止pH值下降； 5．灭菌间隔时光普通不超过4h; 6．培养基如发觉产气、混浊、有菌膜、变色、有菌落、沉淀等应废弃； 7．平皿菌落计数时，肉眼观看，须要时可用放大镜，以防遗漏，计下各平皿的菌落。

[任务实施] 一、生活饮用水 1．取三个培养皿，分离是一个空白、另两个加1.0ml水样； 2．浇养分琼脂培养基(冷却至45℃～50℃，无菌操作)2～3 mm，冷却至室温、凝固后倒置； 3．在37℃，培养24小时后，观看结果并记录。

二、水源水 1．用无菌水稀释水样分离为0.1、0.01、0.001 ml的稀释比； 2．取四个培养皿，分离是空白、0.1、0.01、0.001ml的稀释比的水样加1.0ml水样； 3．浇养分琼脂培养基(冷却至45～50℃，无菌操作)2～3mm，冷却至室温、凝固后倒置； 4．在37℃，培养24h后，观看结果并记录。

量将水涂干。 5. 倒置于37℃培养箱中培养24h。
6.菌落计数： 1）挑取无片状菌苔生长的平板作为计数平板，若片状菌 苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布很均 匀时，可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数。 2）选择平均菌落数在30～300之间的平板来计算该水样的 菌落总数。如果所有的平板的菌落总数都不在30—300 范围之内，则取最靠近30—300的平板进行计数 3） 如果有两个稀释浓度的总菌落数落在了30—300范围 之内，则先计算两个浓度下每ml水体中细菌总数，如果 两个数值的比值大于2则取小的浓度，如若小白胨琼脂培养基，采用平 板菌落计数技术来分别测定自来水和河水中的细 菌总数。
1-7组河水，8-10组自来水
三、实验操作
1.水体取样： 应取距水面10～15cm的深层水样。先将灭菌 的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转 过来，除去玻璃塞，水立即流入瓶中，盛满后， 将瓶塞盖好，再从水中取出。 2. 自来水取样： 打开自来水龙头，让水流流出1min左右，用 烧杯接取自来水。
实验 水中细菌总数的测定
（一）水中细菌总数的测定
一 实验目的

1.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法； 2.了解水源水的平板菌落计数的原则
。
二.实验原理：
本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。 由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长 条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在 一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖， 因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落， 计算出水中细菌总数仅是一种近似值。 目前一般是采用肉膏蛋白胨琼脂培养基。

3. 将河水水样分别稀释成10-1、10-2、10-3三个连 续稀释浓度（注意：在稀释前后一定要充分混匀）、 自来水样不稀释。 注意：河水样的稀释，取1个灭菌空试管，加入9mL 灭菌水。用取过灭菌水的移液管取1mL河水样，放入 试管中，振荡试管混合均匀。